Фермент потеря активности

Влияние внешних условий. По своей природе ферменты значительно более чувствительны к изменению внешних условий, чем неорганические катализаторы. В частности, ферменты работают в значительно более узком диапазоне температур. Температурный оптимум большинства растительных ферментов 313—333 К, животных ферментов 313—323 К. Если температура превысит эти пределы, активность фермента очень быстро падает, а при 343—353 К происходит пх необратимое разрушение, обусловленное денатурацией белка. Лишь очень немногие ферменты способны в определенных условиях выдержать нагревание до 373 К без потери активности. [c.169]

Важнейшие свойства ферментов потеря активности (инактивация) при нагревании, ярко выраженная зависимость активности от концентрации водородных ионов, специфичность действия на субстрат. [c.50]

Ингибирование бывает обратимым и необратимым. Последнее относится к реакциям, приводящим к безвозвратной потере активности фер- мента [33а]. Примером необратимого ингибирования может служить инактивация фермента ацетилхолинэстеразы под влиянием ядов нервно-паралитического действия — фосфорорганических соединений (гл. 7, разд. Г, 1). Часто стадии необратимой инактивации предшествует обратимое связывание ингибитора с комплементарным ему центром на поверхности молекулы фермента. Здесь мы не будем рассматривать математическую обработку кинетических данных, соответствующих необратимому ингибированию, и ограничимся обсуждением количествен лых аспектов действия обратимых ингибиторов. [c.27]

В сложных ферментах функцию активных центров выполняют преимущественно простетические группы, при потере которых ферменты лишаются своей активности, но вместе с тем и белковый компонент отдельными участками своей молекулы влияет на эффективность и специфичность ферментативного действия. [c.106]

Одним из методов выявления функционально значимых групп в ферментах является метод химической модификации. Как правило, эти группы обладают более высокой реактивностью, чем такие же группы, не входящие в активный центр или регуляторный участок. Благодаря этому в какой-то степени преодолеваются ограничения метода, связанные с его недостаточной специфичностью, и применение химической модификации оказывается достаточно эффективным подходом в целом ряде случаев. Для подтверждения специфичности модификации (т. е. для того, чтобы удостовериться, что модификация произошла в-активном центре или другом функционально значимом участке) пользуются критерием защиты от модификации или потери активности в присутствии субстрата или иного специфического лиганда. [c.398]

При иммобилизации ферментов необходимо, чтобы активные группы матрицы ие блокировали каталитич, центр фермента, а условия иммобилизации ие приводили к потере его активности. Определенные ограничения иа способ иммобилизации налагают и особенности субстрата. Так, в случае высокомол. субстратов нельзя использовать методы инкапсулирования или включения фермента в гель, Еслн матрица несет иа себе заряды, то заряд субстрата влияет на кинетич. параметры р-ции разноименные заряды иа носителе и субстрате увеличивают скорость р-ции, катализируемой И. ф,, одноименные заряды ее снижают в м. б. причиной полной потери активности препарата. Заряды носителя и субстрата влияют также иа величину pH, при к-рой скорость ферментативной р-ции максимальна. [c.215]

Многие ферменты дороги и быстро теряют свою активность. Применение бактерий, микроорганизмов и биологических тканей различного происхождения позволяет устранить недостатки, присущие ферментным биосенсорам. При этом отпадает необходимость в получении и очистке ферментов. Однако такие биосенсоры имеют низкую селективность вследствие того, что микроорганизмы, ткани растений и животных являются источниками самых разнообразных ферментов. Кроме того, время отклика биосенсоров на основе тканей и микроорганизмов может быть достаточно большим. Тем не менее, в последнее время наблюдается повышенный интерес к электродам, содержащим не сами ферменты, а их первозданные источники - биологические материалы. Установлено, что тканевые срезы выполняют функцию биокатализаторов. При этом пластины биоматериала могут храниться без потери активности в течение года. [c.504]

Активность трипсина проявляется при pH 7—9 по отношению к некоторым синтетическим субстратам оптимальная активность трипсина наблюдается при pH 7,8 [128]. В этих пределах значений pH фермент легко претерпевает аутолиз максимальная стабильность фермента наблюдается при pH 2,3 н 30° [228]. Трипсин более устойчив в присутствии субстрата. Найдено, что раствор трипсина при pH 7,9 и 26° теряет 50% активности за 30 мин в отсутствие Са + и полностью инактивируется за 6 час [125]. Инактивирование фермента в значительной степени замедляется в присутствии Са + [31, 77, 125]. Так, в указанных выше условиях, но в присутствии 0,01 моля потеря активности составляет всего 5% за 8 час. [c.180]

Необходимо отметить, что различные препараты иммобилизованных ферментов содержат 1—10% белка, а активность ферментов составляет 10—90% исходной активности растворимого фермента. Срок хранения иммобилизованных ферментов при пониженной температуре 3—12 мес без потери активности. В реакторах и колонках иммобилизованные ферменты используются неделями и месяцами, что безусловно дает очень большой экономический эффект по сравнению с использованием растворимых форм ферментов. [c.207]

О белковой природе ферментов свидетельствует факт инактивирования (потеря активности) ферментов брожения при кипячении, установленный еще Л. Пастером. При кипячении наступает необратимая денатурация белка-фермента. Фермент при этом теряет присущее ему свойство катализировать химическую реакцию. Точно так же белки при кипячении денатурируются и теряют свои биологические свойства (антигенные, гормональные, каталитические). Под влиянием различных физических и химических факторов (воздействие УФ- и рентгеновского излучения, ультразвука, осаждение минеральными кислотами, щелочами, алкалоидными реактивами, солями тяжелых металлов и др.) происходит денатурация ферментов, так же как и белков. [c.118]

Ферменты образуются внутри клеток, но они могут действовать и вне клетки, причем их можно выделить из клеток без потери активности. Следовательно, ферментативные реакции можно проводить и во внеклеточной среде. Биокатализаторы — высокомолекулярные белки с определенной надмолекулярной структурой, содержащие активный центр, который обычно находится во впадине (рис. 14.2). Во многих случаях активный центр представляет собой сложную органическую молекулу или ион металла (кофактор) и может быть либо связан, либо не связан с белком гомео-полярной связью. Комплекс белка (апофермент а) с кофактором называют голоферментом. [c.300]

Поскольку у белков, как правило, имеется несколько однотипных аминокислотных остатков, в частности и остатков лизина, то разные молекулы фермента оказываются связанными с носителем через разные аминокислотные остатки. Если такой остаток расположен вблизи активного центра фермента или даже в самом активном центре, иммобилизация может привести к частичной или полной потере каталитической активности. Если же иммобилизация прошла по участку, удаленному от активного центра, то активность у фермента чаще всего остается. Поэтому в целом значительная часть иммобилизованных молекул частично или полностью сохраняет способность катализировать ферментативное превращение и наблюдается лишь падение суммарной активности фермента, ковалентно связанного с полимерным носителем. В связи с этим важной задачей является выбор такого типа иммобилизации, который приводит к наименьшим потерям активности. [c.160]

В отличие от многих природных соединений ферменты обладают тонкой структурой от других белков их отличает особая топография молекул, характерная для активной формы фермента. Высокоспецифическая структура нативного фермента способна легко нарушаться под воздействием внешних факторов. У некоторых ферментов нарушение четвертичной структуры часто влечет за собой потерю активности, причем иногда инактивация необратима. Более глубокие изменения, затрагивающие конформацию всей полипептидной цепи, ведут к денатурации. Известны случаи поверхностной денатурации при контакте фермента с некоторыми сорбентами, основной причиной которой является сильное гидрофобное взаимодействие. Возможность инактивации или денатурации следует всегда учитывать при разработке схемы выделения и фракционирования ферментов. [c.7]

Конечно, не следует подвергать препараты ферментов воздействию высоких температур, кислот и щелочей, окислителей и восстановителей, детергентов или органических растворителей. Однако, работая с ферментами, можно не заметить небольших конформационных изменений, которые, хотя и не приводят к потере активности, способны настолько модифицировать молекулу, что она потеряет всякое сходство с нативным ферментом. [c.7]

Белковая природа ферментов обусловливает их неустойчивость (лабильность), выражающуюся в том, что ферменты теряют активность в неблагоприятных условиях среды. Одним из важнейших факторов внешней среды является температура. Зависимость активности фермента от температуры носит сложный характер (рис. 13). С повышением температуры скорость ферментативного процесса, как и большинства химических реакций, возрастает, но в отличие от них в довольно узких пределах. По достижении определенной температуры, характерной для каждого фермента, наблюдается падение скорости ферментативной реакции. Уменьшение скорости связано с деструкцией белковой части фермента при повышенных температурах и потерей в результате этого каталитической активности. [c.54]

И, наконец, если ферменты по своим физико-химическим свойствам приближаются к растворимым белкам, то они должны, подобно последним, осаждаться из водных растворов без потери активности водоотнимающими средствами, в частности ацетоном, спиртом и сернокислым аммонием. Опыт показывает, что концентрированные растворы нейтральных солей щелочных металлов действительно вызывают осаждение ферментов, причем получаемые осадки полностью сохраняют свои ферментативные свойства. Один из наиболее важных и эффективных методов выделения и очистки ферментов сводится именно к осаждению их нейтральными солями щелочных металлов. [c.121]

Обычный ход выделения и очистки фермента, возрастание его удельной активности, выход на отдельных этапах видны на схеме, приведенной на стр. 210. Для получения высокоочищенного препарата чаще всего приходится применить 6—12 операций (чем их меньше, тем, естественно, лучше). При этом удельная активность фермента может быть повышена в сотни и даже тысячи раз, но потеря активности при этом может составлять до 90% и даже больше. [c.139]

В начале, по-видимому, всегда целесообразно отделить заметную часть балластных белков путем фракционной денатурации прогреванием или осаждением в слабокислой среде. Наоборот, кристаллизацию выгоднее проводить на заключительных этапах очистки. Основными операциями, выполняемыми на средних стадиях, являются фракционирование органическими растворителями, нейтральными солями, адсорбцией или хроматографическим разделением на колонках, в том числе с применением ионообменников. Очень важно, по возможности, чередовать этапы таким образом, чтобы избежать операции диализа. Так, высаливание, удобное в качестве первого этапа, требует диализа, но фракционирование спиртом позволяет его избежать. Простого прибора для быстрого диализа больших объемов жидкостей пока еще не существует можно полагать, что из всех способов очистки диализ — самый медленный и неудобный. Его легче проводить в заключительных стадиях, когда вещества уже мало и объемы невелики. Во время диализа возможны значительные потери активности фермента. С большими объемами жидкостей неудобно работать и в колонках последние лучше использовать [c.155]

Механизм бактерицидного действия хлора и его кислородсодержащих соединений заключается во взаимодействии с составными частями клетки микроорганизма,в первую очередь с ферментами. Потеря биологической активности ферментов может происходить в результате реакций окисления, хлорирования, замещения. Изменения в структуре ферментов ведут к нарущению обмена веществ в клетке микроорганизма и ее отмиранию. [c.151]

Гем-протеиновая связь зарегистрирована с помощью метода Маэли [Maehly, 1952]. Разрыв связи осуществлялся при смешивании в делительной воронке равных объемов метил-этил-кетона и раствора препарата анионных пероксидаз при подкислении смеси 0,1 М H I до кислой реакции —pH от 2,0 до 1,5. В этих условиях опыта начинается быстрое отщепление апофермента от протогемина. Потерю ферментативной активности проверяли, определяя активность фермента до и после опыта по реакции с одним из субстратов — бензидином. После разрыва указанной связи в кислой среде пероксидазная функция фермента полностью утрачивалась. Таким образом, было получено доказательство наличия гем-протеиновой связи у исследуемых анионных изоэнзимов фермента. Потеря активности установлена как для опытных, так и контрольных пероксидаз, следовательно, мы имели дело с истинными пероксидазами, содержащими в составе молекулы геминовую группировку (см. 1.2). [c.87]

Еще один пример, который также находит повседневное применение, касается специфического гидролиза пенициллинамидазой природного пенициллина О в препаративных количествах, при этом опять-таки используется хроматографический процесс [129]. В результате образуется чистый продукт гидролиза — 6-аминопеницнллановая кислота, свободная от примесей, которая затем может быть исиользована для синтеза всех видов полусинтетических производных пенициллина. В противополо/кность нестабильному растворимому ферменту фермент, переведенный в нерастворимое состояние, не проявляет потери активности [c.261]

Свойство ферментов разрушаться при кипячении является характерной особенностью, отличающей ферменты от других катализаторов, и называется термолабильностью ферментов. После непродолжительного кипячения ферменты теряют способность проявлять каталитическое действие. Потеря каталитической активности при кипячении обусловлена денатурацией фермента. При нбпродолж1ительном нагревании некоторые ферменты подвергаются обратимой денатурации (И. П. Павлов), т. е. при постепенном охлаждении снова переходят в активное состояние. Сухие препараты ферментов выдерживают нагревание до 100° без заметной потери активности. При низких температурах ферменты хорошо сохраняются. Повышение и понижение температуры сильно изменяют скорость ферментативной реакции. [c.105]

Третий путь к освоению приемов , которыми пользуется живая природа в своих лабораториях in vivo, состоит в значительных, причем полученных в самые последние годы, достижениях химии иммобилизованных систем. Как было уже сказано, энзимология давно уже накопила информацию об уникальных качествах биокатализаторов. Но вместе с тем она указала и на их крайнюю лабильность, неустойчивость при хранении и быструю потерю активности при перенесении в реакционные системы, функционирующие in vitro. Ведь именно поэтому техническая биохимия не могла пойти далее нескольких ограниченных областей промышленности, где применяются преимуп ественно гидролитические ферменты, выделяемые микроорганизмами. Эти области — производство вин, пива, чая, хлеба и некоторых других пищевых продуктов, обработка кожи. Все попытки использовать богатейший набор ферментов, которым располагает природа, для осуществления лабораторных и промышленных процессов наталкивались на, казалось бы, неразрешимые проблемы 1) трудную доступность чистых ферментов и их непомерно высокую стоимость 2) их нестабильность при хранении и транспортировке 3) быстро наступающую потерю их активности в работе, даже если удалось их выделить и пустить в дело. Но теперь оказалось, что эти проблемы удается решить. Благодаря успехам микробиологической промышленности стало возможным получать многие ранее трудно доступные или недоступные ферменты по ценам в 100—1000 раз ( ) ниже цен на ферменты растительного и животного сырья. Но, главное, теперь открыты пути стабилизации ферментов, и именно это обстоятельство стало основанием химии иммобилизованных систем, или биоорганического катализа . Сущность этого открытия и всех последующих исследований, направ- [c.184]

Аспергиллы являются типичными аэрофилгми, поэтому они могут развиваться только на поверхности твердой или жидкой среды пли в жидкой, достаточно аэрируемой среде. Оптимальная температура для большинства аспергиллов 25—30"С, для некоторых — до 35°С. Большинство грибов прн поверхностно.м культивировании могут переносить кратковременное повышение температуры до 40 п даже 45°С без заметной потери активности ферментов. Оптимальная влажность среды для них около 65%. [c.147]

Фракционирование сульфатом аммония. К полученному супернатанту медленно, при постоянном перемешивании, добавляют хорошо измельченный сульфат аммония до 54%-ного насыщения (320 г/л). При насыщении сульфатом аммония белковый раствор тщательно охлаждают в сосуде с тающим льдом. Перемешивание продолжают в течение 30 мин, атем центрифугируют 20 мин при 10 ООО g. Осадок отбрасывают. К супернатанту добавляют сульфат аммония до 67,5%-ного насыщения (83,5 г/л). Перемешивание продолжают 30 мин и вновь ценгрифугируют. Супернатант отбрасывают, осадок суспендируют в 80%-ном растворе сульфата аммония, содержащем 10 мМ 2-меркаптоэтанол. Концентрация белка в суспензии составляет-20— 40 мг/мл. На этой стадии фермент может храниться при 4° С несколько дней без потери активности. [c.272]

Ионообменная хроматография целлобиогидролаз и целлобиаз протекает, как правило, с высокими выходами ферментов по активности (50-90%). Иная картина наблюдается при очистке эндоглюканаз в режиме сорбции фермента с последующей его элюцией путем увеличения ионной силы. Как уже отмечалось, для этого требуется нанесение фермента при pH 7-8,5, что наряду с длительностью процесса (особенно при использовании мягких носителей типа сефадекс) приводит к значительным, до 90%, потерям активности фермента. Выходом из этого положения является применение более жестких носителей на основе сферона, трисак-рила, методов ВЭЖХ. Как будет показано ниже, это позволяет значительно увеличить разрешающую способность методов при практически полном сохранении активности фермента за счет быстрого проведения процесса. [c.125]

Активность миозина в пробах рассчитывают в микромолях неорганического фосфата за 1 мин на 1 мг белка. Проводят сопоставление кривой титрования сульфгидрильных групп миозина ПХМБ и кривой изменения его активности при разной степени модификации. Отмечают полную потерю активности ферментом при 100%-ном блокировании SH-rpynn, а также 1,5—3-кратную активацию АТФазы при блокировании до 50% SH-rpynn. [c.399]

Наиболее часто в качестве меток используют два фермента —щелочную фосфатазу (ЩФ) и пероксидазу хрена (ПХ). Выбор зависит от возможности оптического детектирования превращения субстратов этих ферментов и от легкости соединения фермента без потери активности. Щелочная фосфатаза представляет димерный гликопротеин с молекулярной массой 140 ООО, содержаний много свободных аминокислот для соединения. Аналогично пероксидаза хрена содержит четыре лизнновых остатка для соединения и имеет молекулярную массу 44000. В некоторых случаях для соединения можно использовать углеводные остатки. [c.594]

Можно вводить метку в а-положение аминокислоты путем декарбоксилирования производных а-ацетиламиномалоновой кислоты см. схему (7) в кислых растворах тритийсодержащего растворителя. Альтернативно, можно вводить метку в а-положение аминокислоты непосредственно в условиях, которые вызывают рацемизацию при а-С атоме, т. е. в сильно щелочных средах или при кипячении с уксусным ангидридом в уксусной кислоте. Однако для проведения многих биологических исследований лучще избегать применения [а- или Р- Н] меченных аминокислот. Обмен трития в этих положениях происходит через реакции трансаминирования схема (32) потеря трития, находящегося в р-положении аминокислот, используется в методе анализа трансаминаз. Обработка а.р-тритированных а-аминокислот с помощью оксидаз аминокислот или почечной ацилазы может приводить к существенной потере активности осторожность следует соблюдать и при использовании ферментов для разделения рацемических аминокислот, меченных радиоактивными изотопами. [c.249]

Ферменты являются белками, поэтому любые агенты, вызывающие денатурацию белка (кислоты, щелочи, соли тяжелых металлов, нагревание), приводят к необратимой инактивации фермента. Однако подобное инак-тивирование относительно неспецифично, оно не связано с механизмом действия ферментов. Гораздо большую группу составляют так называемые специфические ингибиторы, которые оказывают свое действие на какой-либо один фермент или группу родственных ферментов, вызывая обратимое или необратимое ингибирование. Исследование этих ингибиторов имеет важное значение. Во-первых, ингибиторы могут дать ценную информацию о химической природе активного центра фермента, а также о составе его функциональных групп и природе химических связей, обеспечивающих образование фермент-субстратного комплекса. Известны вещества, включая лекарственные препараты, специфически связывающие ту или иную функциональную группу в молекуле фермента, выключая ее из химической реакции. Так, йодацетат I H,—СООН, его амид и этиловый эфир, пара-хлормеркурибензоат lHg—С Н,—СООН и другие реагенты сравнительно легко вступают в химическую связь с некоторыми SH-группами ферментов. Если такие группы имеют существенное значение для акта катализа, то добавление подобных ингибиторов приводит к полной потере активности фермента [c.147]

Знание этих явлений основывается на знаменитом опыте (А. Харден и В. Ж. Юнг, 1904 г.), в котором полученный описанным выше способом сок пивных дрожжей отфильтровывали через фильтр из желатины и разделяли на фильтрат и остаточную жидкость (тождественные результаты получают диализом через мембрану). Каждая жидкость, взятая в отдельности, не производит брожение сахара, но при их смешивании они вновь приобретают свою первоначальную активность. Фильтрат можно кипятить без потери активности остаточная жидкость не выносит кипячения. Отсюда был сделан вывод, что фильтрат содержит диализующееся термостабильное вещество с небольшими молекулами, а остаточная жидкость представляет собой макромолекулярное вещество, чувствительное к действию тепла. В настоящее время известно, что эти макромолекулярные компоненты — собственно ферменты — являются белками и как таковые денатурируются при нагревании. Термостабильные диализующиеся вещества, составляющие активное дополнение ферментов в их каталитических реакциях, были названы коферментами. [c.247]

Изоэлектрическая точка при pH = 7,8—8,0 оптимальные условия действия фермента pH = 7,7, температура 25—65 °С. Очень термостабильна н выдерживает трехминутное нагревание на водяной бане при 90 °С с ничтожной потерей активности (это свойство используется для освобождения фермента от следов других протеолитически активных ферментов, присутствующих в большинстве препаратов). Под действием пепсина рибонуклеаза разрушается, трипсин и хи-мотрипсин на нее ие действуют. [c.338]

Расщепление ферментных белков протеолитическими ферментами чаще всего ведет к потере активности. Однако не менее чем в четырех случаях удалось отщепить заметную часть белка без значительных изменений активности. Так, при автолизе пепсина были найдены низкомолекулярные (диализируемые) пептиды, сохранившие часть активности. От молекулы папаина было отщеплено 109 аминокислотных остатков из 185, причем активность сохранилась. Подобный же результат был получен при частичном гидролизе фосфопируват-гидратазы (с помощью лейцин-амино-пептидазы с N-конпа) и т. д. Подобные эксперименты, несомненно, позволят подойти к выделению и расшифровке активных участков ферментных белков. [c.76]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология