Вирусы, дефектные по репликации

Ретровирусы можно рассматривать как природные векторы для переноса и экспрессии чужеродных генов. Ретровирусы с высокой степенью онкогенности быстро и весьма эффективно вызывают опухоли у млекопитающих и, как правило, способны трансформировать соответствующие клетки в культуре. За одним лишь исключением (разд. 9.3.3), эти вирусы дефектны по репликации, поскольку онкогенные последовательности клеточного происхождения заместили у них те вирусные последовательности, которые кодируют гранс-действующие функции [16]. Вирусные продукты, необходимые для репликации и интегра ции таких дефектных вирусов, обеспечиваются по транс-схеме не- [c.278]

Использование ретровирусных векторов имеет и еще один большой недостаток. Хотя эти векторы создаются так, чтобы они были дефектными по репликации, геном штамма ретровируса (вируса-помощника), который необходим для получения большого количества векторной ДНК, может попасть в то же ядро, что и трансген. Несмотря на все принимаемые меры, ретровирусы-помощники могут реплицироваться в организме трансгенного животного, что совершенно недопустимо, если этих животных предполагается использовать в пищу или как инструмент для получения коммерческого продукта. И поскольку существуют альтернативные методы трансгеноза, ретровирусные векторы редко используются для создания трансгенных животных, имеющих коммерческую ценность. [c.419]

Рис. 38.4. У дефектных в отношении репликации трансформирующих вирусов часть вирусной последовательности замещена последовательностью клетки. Длина замещенной последовательности характерна для каждого вируса.

Чтобы получить вирусный препарат на основе дефектного по-репликации рекомбинантного ретровирусного вектора, плазмидную ДНК, содержащую провирусную форму рекомбинанта, необходимо ввести в клетки, способные упаковать ретровирусную РНК в вирусные частицы. Для этой цели подходят, например, линии фибробластов, продуктивно инфицированные соответствующим хелперным вирусом — получается вирусный препарат, представляющий смесь рекомбинантного и хелперного геномов (разд. 9.4,2). Альтернативный вариант — использование ретровирусных упаковывающих клеточных линий для получения вирусных препаратов, свободных от хелперных компонентов. [c.287]

Казалось бы, нет причин, исключающих использование вирусам и-сате.п-литами структурного белка вируса-помощника. Такая система будет отличаться от многокомпонентного вируса тем, что репликация каждого компонента системы протекает совершенно независимо. Не исключена также возможность существования многокомпонентных вирусов-сателлитов. Такой многокомпонентный вирус-сателлит, способный использовать тот ке, структурный белок, что и вирус-помощник, следует попытаться обнаружить в препаратах вирусов с дефектными частицами неизвестной функции. [c.202]

MOM без El-области и последовательности, ответственной за упаковку, провели котрансфекцию клетки-хозяина, экспрессирующей Е1-гены. Молекула ДНК аденовируса, дефектная по репликации и упаковке, поставляет гены для синтеза компонентов вируса, а продукт лигирования реплицируется и упаковывается в вирусные частицы. При этом около 99% высвобождаемых вирусных частиц содержат молекулу ДНК с терапевтическим геном (генами). С помощью центрифугирования их можно отделить от дефектных по репликации вирусов, которые все же образуются в незначительном количестве. ДНК-клонирующая емкость такой системы достигает 28 т. п. и. [c.496]

Рис. 38.5. Дефектные в отнощении репликации вирусы могут возникать благодаря интеграции и делеции вирусного генома, в результате чего образуются сливщиеся вирусно-хлеточные транскрипты, которые упаковываются вместе с нормальным

Несмотря на то что свободные от хелперов вирусные препараты дефектны по репликации, они обладают высокой инфекци-онностью. Благодаря вирусным белкам, заключенным внутри вириона, эти вирусы эффективно заражают пермессивные [c.287]

Пятый — самый большой — сегмент РНК кодирует NP. Для шта ма PR8 NP представляет собой основную, богатую аргинино молекулу, состоящую из 498 аминокислот [280]. В основном пол. -гали, что транскрипция вирусной РНК осуществляется в комплез сах, состоящих из одного или бо.тее белков Р, так же как и NP, подобные комплексы, выделенные из инфицированных клеток проявляли транскрипционную активность [35, 42, 106, 211, 24С Однако недавно появилось сообщение о выделении активно] комплекса транскриптазы РНК, содержащего только три белка I NP был удален двумя циклами центрифугирования в S2SO4 [lit Большое количество мутантов с ts-повреждениями в гене NP ок. залось дефектным по последним стадиям цикла репликации вир са, включая синтез вРНК и созревание вируса. [c.224]

Третий мутант с дефектным сегментом 8 РНК — tsG412 — имеет поздний дефект в вирусной репликации [123]. Этот мутант был получен путем 5-ФУ-мутагенезом от N-рекомбинанта вируса FPV/Rosto k (90/N3), который несет сегменты 2 и 8 РНК от вируса N, а все остальные — от вируса FPV. При непермиссивной температуре все виды вирусспецифической РНК синтезируются нормально, и активность РНК-зависимой РНК-полимеразы не ослаблена в клетках, инфицированных tsG412, по сравнению с таковой [c.231]

Механизм, с помощью которого ДИ РНК интерферируют с репликацией стандартной РНК, еще полностью неизвестен. Для 5 ДИ РНК несегментированных вирусов с минус-цепью установлено, что поскольку у них отсутствует З -конец генома, но имеются на их З -конце переменные последовательности с более высокой аффинностью для полимеразы, они интерферируют с репликацией стандартного генома, конкурируя за ограниченное число молекул полимеразы [54]. С другой стороны, поскольку ДИ РНК вируса гриппа содержат оба 5 и 3 геномных конца и функционируют как матрицы транскрипции, маловероятно, что они имеют измененные сайты связывания полимеразы на своих концах. Поэтому также маловероятно, что предложенный для интерференции 5 ДИ РНК механизм является основным способом интерференции для 5 —3 ДИ РНК. Хотя окончательное направление интерференции ДИ вирусами гриппа в настоящий момент не может быть выделено, полученные данные предполагают наличие нескольких возможностей, которые могут быть экспериментально проверены. Во-первых, ДИ РНК могут интерферировать на уровне первичной транскрипции. Действительно, такой способ интерференции был предложен для ДИ LT VSV, который также относится к 5 —3 типу [57]. Во-вторых, поскольку трапскрипты ДИ РНК обладают характеристиками РНК, они могут быть транслированы, продуцируя дефектные, подобные полимеразе белки. Эти белки, если они продуцируются, могут связываться предпочтительно со спе- [c.268]

Препараты 5У40 и вируса полиомы, полученные при высокой множественности инфекции, могут содержать различные формы вирионов (в том числе ДИЧ), которые возникают за счет перемещений, повторений и делеций в вирусной ДНК. Кроме того, возможен обмен между участками вирусного генома и ДНК клетки-хозяина. Сохраняя ориджин репликации (точку инициации репликации), дефектные вирусы способны нормально реплицироваться в присутствии вируса дикого типа и формировать дочерние вирионы. Эти дефектные вирусы при наличии двух и более орнджинов репликации могут иметь даже некоторые селективные преимущества в процессе репликации [8]. После 3—5 серийных пассажей инфекционный титр таких вирусных препаратов падает до 10% и ниже по сравнению с исходными препаратами без заметного уменьшения числа вирусных частиц. Для некоторых экспериментов гетерогенность популяции вирусных частиц не имеет значения для других чистота вирусного препарата строго обязательна. В этом случае вирус должен быть исследован дополнительно (см. [c.226]

Получение временной экспрессии генов в клетках OS часто используется для быстрой наработки рекомбинантных белков и ДНК. При конструировании клеток OS клетки зеленой мартышки V-1 были трансформированы вирусом SV40 с дефектной областью начала репликации. В результате были получены три линии клеток ( 0S-1, 2 и 7), конститутивно экспрессирующих большой Т-антиген вируса. После проведения трансфекции клеток экспрессирующими плазмидами, содержащими область начала репликации вируса SV40, последняя эффективно взаимодействует с эн- [c.180]

Для всех клеток, за исключением клеток членистоногих, репликация тогавирусов является летальным событием. При этом в клетке почти полностью подавляется синтез макромолекул и очень быстро блокируется функционирование Na/K-АТРазы [29]. Однако известны многочисленные хорошо документированные случаи, когда устанавливается персистентная инфекция. Большинство из них характеризуется низким содержанием вируса или дефектными формами вирусного генома. Некоторые из дефектных вирусов фенотипически проявляются как температурочувствительные мутанты или мутанты по типу бляшек. Другие имеют свойства дефектных интерферирующих (ДИ) частиц [11, 95]. ДИ-частицы представляют собой обычный продукт большинства систем вирус—клетка они содержат делеционный вариант вирусного генома, в котором сохраняются участки, необходимые для репликации нуклеиновой кислоты и ее упаковки в вирионы. У большинства ДИ-частиц нормальные последовательности генома перетасованы, но в то же время определенные области сохраняются. У SFV и SIN последние состоят из З -конца и последовательности около 5 -кон-ца РНК [44, 55, 57, 82] (рис. 21.2). Наиболее интересная последовательность недавно обнаружена у двух ДИ-РНК SIN. На 5 -конце РНК этих ДИ-частиц последовательности практически идентичны тРНК Р клеток крысы [57]. Возможное значение этой структуры обсуждалось ранее в связи с репликацией РНК. В присутствии ДИ-РНК репликация нормальной вирусной РНК подавлена и репликация вируса оказывается угнетенной. При этом инфекция становится намного менее цитопатической и клетки могут выжить. Персистентная инфекция такого типа обычно оказывается временной она заканчивается либо полным излечением (т. е. потерей всей вирусной генетической информации), либо самопроизвольным кризисом с обильной продукцией вируса и цитопатическим действием. Эти состояния имитируют некоторые вирусные заболевания (хотя в последних важную роль в подавлении размножения вируса играют иммунные защитные механизмы), а иногда, возможно указывают на существование необычных типов патогенности. [c.360]

Биологическое значение диплоидности (или полиплоидно-сти) аренавирусов неизвестно. Она может увеличивать генетическую стабильность, Б этой связи сообщалось, что /s-мутанты аренавирусов трудно индуцировать и выделить [245], Это может быть также результатом образования полиплоидов, например, если /s-мутантная РНК упаковывается вместе с летальной мутантной РНК или РНК дикого типа. Получены данные, свидетельствующие о том, что некоторые /s-мутанты по РНК L вируса L M действуют как мутаторы (т, е. совместное заражение такими мутантами и вирусом дикого типа дает необычно большое количество /s-мутантов, включая мутанты по сегменту РНК, отличному от того, в котором содержалась исходная мутация) [11]. Возможно, что мутаторы имеют дефектную РНК-полимеразу, для которой характерна пониженная точность репликации. [c.400]

Иногда в репликации происходят ошибки, что приводит к появлению дефектных частиц [21]. Впрочем, реальную частоту ошибок репликации определить невозможно, поскольку отбором закрепляются только те дефектные частицы, которые имеют преимущества в репликации по сравнению со стандартным вирусом. При образовании дефектных частиц концы генома в общем сохраняются, поскольку как плюс-, так и минус-цепи этих частиц должны сохранить способность инкапсидироваться N-белком и узнаваться вирусной полимеразой. [c.432]

Как предполагают, ДИ-частицы образуются при отсоединении комплекса полимераза — строящаяся цепь от матрицы и завершении репликации на другой матрице или в другом месте той же матрицы. В случае дефектных частиц типа сковорода с ручкой РНК-полимераза с присоединенной дочерней цепью, используя строящуюся цепь как матрицу, возобновляет репликацию в определенном сайте новообразованной цепи, отстоящем от 5 -конца на 43—48 оснований. Этот процесс приводит к появлению комплементарных концов длиной около 50 нуклеотидов (ручка сковороды ). Образование ДИ-частиц типа застежка или шпилька объясняется другой моделью. Согласно этой модели, матрицу реплицируют одновременно две молекулы полимеразы. Вторая молекула, догнав первую, проходит через репликативную вилку и в результате синтезирует РНК, состоящую из двух комплементарных половинок. Поскольку ДИ-частицы описанных двух типов содержат 5 -конец стандартного вируса, они должны были образоваться в ходе синтеза минус-цепи (при использовании плюс-цепи в качестве матрицы). Внутренние делеции, характерные для ДИ-частиц двух других типов, могли образоваться в результате возобновления репликации на той же матрице или матрице такой же полярности, но какой именно, плюс или минус, мы не знаем. Неизвестно также, почему большинство ДИ-частиц относится к классу сковорода с ручкой или шпилька . Возможно, они лучше отбираются по той причине, что содержат предполагаемые высокоэффективные сайты связывания полимеразы как на плюс-, так и на мйнус-цепях в отличие от других ДИ-частиц, содержащих интактные 3 - и 5 -концы стандартного вируса. В пользу этого предположен ния говорит тот факт, что НКЬТ2, идентичный мутантам с внутренней делецией, но содержащий на З -конце 70 дополнительных нуклеотидов, избирательно накапливается при повторных пассажах. [c.433]

Принимая во внимание сложный механизм гибели клетки при рабдовирусной инфекции, кажется вероятным, что персистентная инфекция отражает не нарушение специальной летальной функции вируса, а угнетение вирусных функций ниже уровня, необходимого для гибели клетки. До сих пор непонятно, почему в популяции вирулентного вируса отбору подвергаются частицы, дефектные по репликации. Хотя вирусы, выделенные при персистентной инфекции, чувствительны к температуре, клеточные культуры обычно ведутся при температурах, полностью пермиссивных для вирусов дикого типа и лишь полупер-миссивных для /s-мутантов. Тем не менее такие мутанты распространяются в культуре. Эксперименты по коинфекции показали, что /s-мутанты VSV способны подавлять репликацию вируса дикого типа, ж то время как репликация самих мутантов лишь усиливается [50]. Эти результаты объясняют, почему /s-мутанты поддерживаются в популяции и даже пользуются [c.442]

Для вирусов гриппа описана также внутрисегментная (генная) рекомбинация [58], однако частота ее столь низка, что роль этого процесса в природной изменчивости минимальна. Тем не менее полученные данные указывают на то, что репликативный аппарат вируса гриппа способен в ряде случаев отсоединяться от матрицы, с которой он был связан. Очевидно, в этих случаях происходит преждевременная терминация на исходной матрице и комплекс репликативных белков (репликаза) возобновляет синтез на другой, гомологичной цепи (механизм смены матрицы). Такая преждевременная терминация приводит к появлению различного рода мутантов. Например, возобновление синтеза может произойти не точно в сайте терминации, а на несколько нуклеотидов дальше. При этом независимо от того, используется ли для возобновления репликации исходная цепь или гомологичная ей, образуются делеционные мутанты. Делеционные мутанты, сохраняющие концевые последовательности, служащие сигналами инициации синтеза РНК, часто образуются у вирусов с негативным РНК-геномом. Они называются дефектными интерферирующими частицами (ДИ-частицами) (гл. 7). Их дефектность обусловлена утратой генетической информации для синтеза необходимых белков, а способность интерферировать с полноценным вирусом объясняется высоким сродством к ферментативному аппарату репликации. Пока для вируса гриппа описаны ДИ-РНК, являющиеся производными сегментов РНК с 1-го по 3-й. Однако нет оснований считать, что другие сегменты устойчивы к накоплению делеций. Примером того, насколько резкие изменения может претерпевать репликативный комплекс вируса гриппа, служит рекомбинантная ДИ-РНК, описанная Филдсом и Уинтером [17]. Она содержит пять разных участков из третьего сегмента и, кроме того, область длиной 60 нуклеотидов из первого сегмента. Несмотря на измененную внутреннюю структуру, такая РНК поддерживается в популяции, поскольку содержит на обоих концах последовательности стандартного вируса. Недавно было показано [И]. что наиболее распространенные ДИ-РНК вирусов гриппа с одной внутренней делецией мо- [c.468]

В процессе пассирования HSV-1 при высокой множественности заражения культуры клеток в популяции вируса происходит постепенное накопление вирусных частиц с дефектным геномом. Как выяснилось, их геном имеет размер около 150 тпн и состоит из множества тандемно повторенных фрагментов ДНК HSV-1 размером от 3 до 30 тпн, содержащих последовательности, необходимые для репликации и созревания вирусной ДНК. Наличие в дефектном геноме множественных ori приводит к тому, что он имеет преимущество при репли- [c.388]

В 1981 г Д. Влажны и Н. Френкель показали, что после трансфекции культуры клеток кролика смесью нативной ДНК вируса простого герпеса и мономерной повторяющейся единицы (8,3 тпн) дефектного HSV-1 образуется полноразмерный (около 150 тпн) дефектный геном, состоящий из тандемных повторов введенного фрагмента 8,3 тпн. По-видимому, такой вирусный геном получался в результате репликации мономерной единицы по механизму катящегося кольца. При этом нативная ДНК HSV-1 обеспечивала транс-функции, необходимые для репликации и созревания вирусной ДНК. Дефектный геном эффективно упаковывался в капсиды. Аналогичные результаты были получены в 1982 г, когда в клетки кролика котрансфекцией с нативной ДНК HSV-1 ввели повторяющийся 5й Л1-фрагмент (3,9 тпн) дефектного вируса простого герпеса штамма Patton. [c.388]

Смотреть страницы где упоминается термин Вирусы, дефектные по репликации: [c.249] [c.198] [c.249] [c.263] [c.135] [c.279] [c.292] [c.162] [c.227] [c.269] [c.180] [c.189] [c.190] [c.180] [c.162] [c.227] [c.269] [c.192] [c.156] [c.157] [c.176] [c.383] [c.358] [c.359] [c.361]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология