Равновесное ультрацентрифугировани

В отличие от скорости седиментации равновесное ультрацентрифугирование позволяет на основе термодинамики определить молекулярный вес М. В опытах по изучению равновесия, проводимых в ультрацентрифуге, центрифугирование продолжается до тех пор, пока стремление молекул к седиментации не уравновесится противоположным стремлением к диффузии в область с более низкой концентрацией. Поскольку такое перераспределение в растворе является равновесным, соотношение между концентрациями на двух уровнях и молекулярным весом можно вывести с помощью термодинамических методов. Для идеальных растворов молекулярный вес может быть вычислен по формуле [c.616]

ВЫХ оснований или нуклеотидов, полученных после расщепления полимера (подробнее — см. стр. 58). С нуклеотидным составом ДНК однозначно связаны два физических свойства двухцепочечных комплексов, которые часто используются для характеристики полученных препаратов 2 . 2в Одно из них — так называемая температура плавления Гщ — это температура, при которой происходит распад двухцепочечного комплекса на одноцепочечные молекулы этот процесс легко наблюдать по изменению УФ-поглощения или оптического вращения раствора (подробнее см. в гл. 4). Другая характерная константа ДНК — плавучая плотность р — может быть определена из результатов равновесного ультрацентрифугирования Такое центрифугирование проводят обычно в растворах солей, обладающих высокой плотностью чаще всего применяют хлорид или сульфат цезия. При длительном центрифугировании устанавливается градиент плотности раствора, а ДНК собирается в узкой зоне, где существует равновесие между центробежной силой и выталкивающей силой, которая определяется разностью плотности осаждаемого вещества и применяемого солевого раствора в данной зоне. Равновесное центрифугирование в градиенте плотности Сз С1 может служить не только аналитическим методом для характеристики препарата ДНК, но и полезным препаративным методом для разделения ДНК, различающихся по нуклеотидному составу. Подобным же образом препаративное ультрацентрифугирование в градиенте плотности сахарозы используется для разделения молекул ДНК, различающихся по скорости седиментации. [c.31]

Информация первого типа может быть получена лишь такими методами, которые прямым образом воспроизводят д М) в виде линейного, нелинейного или лапласова преобразования. К числу этих методов относятся скоростное и равновесное ультрацентрифугирование, некоторые типы оптических и электрических измерений (гл. 2) и, с известными оговорками, фракционирование и иногда электронная микроскопия [40]. [c.28]

Для транспортных методов вообще принципиальна эквивалентность варьирования х или t. В этом плане равновесное ультрацентрифугирование, когда распределение С (х) уже перестает зависеть от времени, не является транспортным методом, поэтому мы лишь кратко останавливаемся на этом способе определения молекулярной массы и полидисперсности полимеров. [c.8]

РАВНОВЕСНОЕ УЛЬТРАЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕ РАСТВОРОВ ПОЛИМЕРОВ [c.23]

Интерферограмма Рэлея имеет вид семейства параллельно смещенных кривых. Вертикальное смещение этих кривых пропорционально разнице в коэффициентах преломления, отвечающих двум секторам (раствор и растворитель) интерференционной ячейки. Число смещенных полос определяется уравнением (П1.4). Соответствующее изменение концентрации описывается уравнением (III. 1). Впрочем, обычно нет необходимости пользоваться этими уравнениями, поскольку седиментационные данные можно представлять прямо в виде числа смещенных полос или даже при помощи непосредственных измерений расстояний на фотопластинке. Это упрощение оправдано в случае равновесного ультрацентрифугирования, так как для расчетов по уравнению (VI. 2) необходимо знать лишь разность логарифмов концентраций. Несложный анализ покажет читателю, что коэффициент пропорциональности, связывающий концентрацию со смещением полос, не влияет на наклон графика зависимости In с от х , а лишь вызывает ее смещение. На фиг. 22 приведены обычно встречающиеся типы интерферограмм Рэлея. [c.102]

При равновесном ультрацентрифугировании с использованием двухсекторной ячейки для образования границы седиментации обычно уровень растворителя в одном секторе устанавливают чуть-чуть выше уровня раствора в другом секторе. Простые соли при этом распределяются в центробежном поле практически одинаково в обоих секторах, никак не отражаясь на седиментационной диаграмме, так что оптика Рэлея регистрирует только распределение концентрации исследуемого вещества. На фиг. 23 показаны фотографии седиментационных диаграмм, отвечающие схемам, приведенным на фиг. 22. Фотография, приведенная на фиг. 23, Л (результаты опыта с ячейкой для искусственного образования границы), сделана через некоторое время после наслаивания, чтобы были яснее видны интерференционные полосы в области границы. На фотографиях, сделанных сразу после ее образования, полосы были бы расположены очень тесно. В дальнейшем они расходятся за счет диффузии.) [c.104]

Метод равновесного ультрацентрифугирования в градиенте плотности находит применение для исследования образцов, однородность которых по плотности известна, таких, как некоторые препараты ДНК. Крупные молекулы для такого исследования более удобны, так как они образуют узкие полосы, и градиент плотности в пределах этих полос мало отличается от линейного. Этот случай удобен для теоретического анализа и прост для измерений. [c.129]

РАВНОВЕСНОЕ УЛЬТРАЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕ В ГРАДИЕНТЕ ПЛОТНОСТИ СУЛЬФАТА ЦЕЗИЯ [c.192]

Молекулярный вес определя.чи равновесным ультрацентрифугированием. [c.260]

Средневесовой молекулярный вес находят методом светорассеяния или методом равновесного ультрацентрифугирования, но только в том случае, если распределение концентраций раствора в кювете находят по изменению абсорбции света. Если распределение концентраций находят по изменению градиента показателя преломления, то получают так называемый г-средний молекулярный вес М , который вычисляется по следующей формуле [c.16]

Точно так же разнообразные методы могут быть использованы для изучения ассоциации макромолекул друг с другом. Такая ассоциация будет приводить к увеличению молекулярного веса, и любой метод определения молекулярного веса (осмометрия, светорассеяние, равновесное ультрацентрифугирование) можно применить для изучения агрегации макромолекул. Часто полезным оказывается использование явлений, связанных с внутренним трением, хотя интерпретация экспериментальных данных может быть несколько неопределенной. Рассмотрим, например, влияние димеризации на характеристическую вязкость [т]] удлиненной жесткой частицы. Мы видели (гл. VI, раздел В-1), что [г)] является функцией осевого отношения гидродинамически эквивалентного эллипсоида вращения. Процесс димеризации может привести к увеличению или уменьшению характеристической вязкости в зависимости от того, происходит ли ассоциация по типу конец к концу или путем параллельного расположения, что обусловливает увеличение или уменьшение асимметрии частицы (рис. 117). Действительно, легко представить ассоциацию, при которой пара взаимодействующих частиц имеет асимметрию, подобную асимметрии отдельной частицы, и, таким образом, [г)] не изменяется в процессе ассоциации. Рассматривая влияние агрегации на скорость седиментации в ультрацентрифуге, можно сделать но крайней мере качественный вывод об ускорении седиментации. Это следует из того, что скорость седиментации пропорциональна отношению молекулярного веса к коэффициенту поступательного трения, и любое гидродинамическое взаимодействие вообще будет уменьшать коэффициент трения ком- [c.311]

Был разработан также ряд очень чувствительных методов, в которых непосредственно наблюдаемой величиной является градиент концентрации, а не сама концентрация. К числу этих методов принадлежит так называемый шлирен-метод, который был использован Свенссоном [454, 455] в ставшей очень популярной оптической системе. Этот метод основан на том, что луч света, проходящий через среду с градиентом показателя преломления перпендикулярно направлению распространения света, отклоняется в направлении увеличения показателя преломления п, причем отклонение пропорционально величине градиента. Этот принцип использовался также при расчете скорости смещения изображения освещенной щели в зависимости от градиента концентрации, существующего в кювете, через которую проходит свет. Так как зависимость показателя преломления разбавленных растворов от концентрации растворенного вещества является линейной, то с помощью шлирен-метода можно получить градиент концентрации в кювете центрифуги при условии, что инкремент показателя преломления (дп/дс2)т определен заранее. Градиенты показателя преломления можно также определить с помощью интерферометров. По мнению Шахмана [449], этот метод наиболее перспективен для будущего усовершенствованрш равновесного ультрацентрифугирования. [c.158]

Высокоскоростные роторы с пробирками относительно большого объема. Роторы 42.1, 50.2 Ti, 55.2 Ti, 60 Ti и 70 Ti имеют пробирки объемом по 38,5 мл, роторы 35 и 45 Ti — по 94 мл. Угол а для большинства этих роторов лежит в интервале 23— 25°, а у ротора 42.1 а=30°. Значения г а с, естественно, больше, чем у роторов предыдущей группы (9—10,4 см), тогда как значения г в такие же, как в группе 1 (3,5—3,9 см). Дальше обычного отстоят от оси вращения пробирки ротора 50.2 Ti, несущего 12 пробирок объемом по 38,5 мл (г ин=5,3 см, г а с= Ю,8см). Роторы этой группы, помимо осаждения частиц из разбавленных суспензий, могут также быть использованы для равновесного ультрацентрифугирования. [c.183]

Как следует из результатов измерений э. д. с. растворов, КвТзеОхэ-16Н2О растворяется в разбавленном растворе КОН без заметного протонирования аниона методами светорассеяния и равновесного ультрацентрифугирования было показано, что в водных растворах танталата единственным анионом является анион [ТЗбО ] - [97]. [c.42]

Исследованию разветвленности макромолекул посвящено большое число работ. Скорость седиментации 5р разветвленных молекул обычно выше, чем линейных той же массы. Например, согласно теории [245 ] 5р = где к — отношение стоксовских радиусов разветвленной и линейиоймакромолекул одинаковых М. Однако эти коэффициенты отличаются не намного. Поэтому, если разветвленность макромолекул сопровождается полимолекуляр-ностью образца, проследить эту закономерность трудно. Так, Камада [246] пришел к выводу о нечувствительности скоростной седиментации к ветвлениям с функциональностью, равной четырем, а авторы работы [247] вообще считают скоростную седиментацию непригодной для определения разветвленности молекул полидисперсных полимеров. Признаком отсутствия разветвленности макромолекул слабо дисперсных полимеров может служить линейность зависимости 5 от lg [т] ] (с наклоном, равным единице) в 0-условиях [248]. Равновесное ультрацентрифугирование очень полидисперсных разветвленных полимеров исследовано в работе [249]. [c.124]

Метод седиментации — диффузии не получил широкого распространения, так как его применение требует специальных экспериментов для определения коэффициента диффузии. Одно время казалось, что применение этого метода целесообразно в тех случаях, когда трудно очистить препарат настолько, насколько это необходимо для равновесного ультрацентрифугирования. Однако при работе с недостаточно чистым препаратом возникает неопределенность— не ясно, какого типа средняя молекулярная масса измеряется методом седиментации — диффузии. Юлландер [5] показал, что этот метод дает значение молекулярной массы, промежуточное между Мп и Ми, и обычно более близкое к Л1( . Относительное положение значения этой молекулярной массы на соответствующем графике зависит от характера молекулярно-весового распределения. Описанный метод по количеству анализируемого вещества не столь экономичен, как равновесные методы. Его, однако, часто применяют для дополнительной проверки значений молекулярной массы, полученных другими способами. [c.106]

Этот метод, описанный Ла Баром [12], состоит в том, что в конце равновесного ультрацентрифугирования при малой скорости (без отрыва от мениска) на короткое время скорость вращения увеличивают, что приводит к уходу вещества из области мениска. Определение начала отсчета концентрации для концентрационной кривой на диаграмме Рэлея (в действительности кривой изменения коэффициента преломления) для низкоскоростных методов является проблемой, поскольку в этом случае на интерферограмме отсутствует область с нулевой концентрацией. Ла Бар показал, что вертикальное смещение вниз полос в области мениска за счет кратковременного вращения при большой скорости может дать недостающую информацию либо непосредственно, либо после расчета. На первый взгляд может показаться, что мы не получаем ничего нового по сравнению с методом Ифантиса (снижением концентрации вещества у мениска до нуля) [9], однако подход Ла Бара оправдан тем, что метод Ифантиса не позволяет использовать данные, относящиеся к области дна ячейки, где интерференционные полосы проходят очень круто, тогда как по Ла Бару для вычисления величины М , можно использовать интерферограмму, соответствующую любой точке раствора. Для систем, в которых происходит ассоциация частиц, этот метод также более приемлем. Высокоскоростная часть опыта кратковременна, так что эффект увеличения крутизны полос около дна ячейки несуществен до тех пор, пока это не мешает измерению их смещения. [c.114]

Касасса и Эйзенберг [13] показали, что если в уравнения, описывающие равновесное ультрацентрифугирование, вместо величины (1—ир) подставить производную др дс, то они дают истинные значения молекулярной массы для негидратированных молекул. Величину др дс следует определять экспериментально, сравнивая раствор белка с растворителем, против которого этот белок был тщательно отдиализован. [c.220]

Краус, Джонсон и Холмберг [107] провели предварительное исследование поведения тория (IV) в нерхлоратных растворах методом равновесного ультрацентрифугирования. Было установлено существование полимерных частиц, по-видимому, в равновесии друг с другом, но существование особенно устойчивых продуктов гидролиза низкого молекулярного веса не доказано. Краус полагает, что на ранних стадиях гидролиза существенную роль могут играть и мономолекулярные частицы, хотя относительно последних стадий существует единое мнение, что доминирующими являются многоядерные комплексы. Краус [107] и Килпатрик [108] показали, что надо учитывать также и другие анионы, которые могут присутствовать в растворе. Анионы будут конкурировать с молекулами воды и ионами ОН за свободные положения в координационной сфере иона металла и тем самым будут разрушать мостики и уменьшать степень полимеризации. Арланд (см. гл. V, разд. 10.3) нашел, например, что уранил-ион образует многоядерные комплексы в перхлоратном растворе, но если анионом является тиоцианат, монохлорацетат, то никаких признаков образования многоядерных комплексов не наблюдается. Очевидно, что эти ионы образуют с ионом уранила прочные комплексы. [c.64]

Общие замечания [53, 54]. Большинство видов нативной ДНК являются малопригодными объектами для изучения методами равновесного ультрацентрифугирования из-за их высокого молекулярного веса и низких коэффициентов диффузии. Оказалось, что очень длительное центрифугирование и (или) низкие скорости вращения ротора совершенно неприемлемы для ДНК. Однако для ДНК с небольшим молекулярным весом этот метод в принципе может быть использован. Один из таких образцов (ДНК, дегра,дированная нод действием кислоты до молекулярного веса 25 ООО) был изучен методом Арчибальда [114]. [c.240]

Чтобы уменьшить время работы ультрацентрифуги, Ифантис [41] предложил использовать ячейку с 6 отдельными камерами, что дает возможность работать сразу с тремя концентрациями образца. Эти ячейки теперь имеются в продаже, однако работать с ними труднее, чем с обычными ячейками. В статьях Ифантиса можно найти подробное описание методики работы и изложение теоретических основ данной модификации метода равновесного ультрацентрифугирования. [c.265]

При равновесном ультрацентрифугировании в СзС1 очищенная ямДИК с размерами около 10 т. п. н. взвешивалась в зоне с плотностью 1,69 г/см , что соответствует плотности сателлитной ДНК мыши. При переваривании рестриктазой ЕсоН был получен набор дискретных фрагментов с размерами, кратными 245 п. п., что также характерно для сателлитной ДНК, состоящей из коротких повторяющихся последовательностей. Таким образом, длинные защищенные [c.116]

С. В. Разиным и В. В. Чернохвостовым была сделана попытка детально охарактеризовать комплексы ДНК с ПСБ. Фрагменты ДНК длиной в 1—2 т. п. н., связанные с ПСБ, очищали и подвергали равновесному ультрацентрифугированию в градиенте плотности СзС1. Их плавучая плотность оказалась равной 1,7 г/см , т. е. она соответствовала плавучей плотности свободной ДНК, не содержащей белка. В ходе опытов, поставленных для объяснения этого парадокса, было обнаружено, что обработка ДРНКазой ведет к уменьшению плавучей плотности комплексов до 1,62—1,65 г/см . Приблизительные расчеты, основанные на плотности белка (- 1,3 г/см ) и РНК (- 1,9 г/см ), показывают, что на каждую молекулу ДНК приходится около 150 кДа белка и около 200 нуклеотидов РНК- Природа этой РНК неясна, но получены данные о ее гомогенности и уникальной нуклеотидной последовательности. [c.161]

Эти величины получены из уравнения Шераги — Манделькерна и методом равновесного ультрацентрифугирования. [c.134]

Равновесное ультрацентрифугирование в градиенте плотности солей тяжелых металлов. Этот метод, впервые предложенный Мезельсоном с сотр. [565] в 1957 г., широко применяется для фракционирования макромолекул по их плавучей плотности Кроме того, он дает возможность получать уникальную информацию о зависимости плотности молекулы от ее химического состава [565], о механизме репликации ДНК о процессах денатурации и ренатурации ДНК [530]. Теория этого метода и наиболее полная информация о возможности применения изложены в некоторых руководствах [56, 565, 710]. [c.180]

Кроме равновесного ультрацентрифугирования в градиенте солей тяжелых металлов, можно использовать нреформированный градиент Приготовление его описано в разделе Градиентное центрифугирование . В этом случае удается сократить время центрифугирования примерно в 2 раза. [c.181]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология