Ультрацентрифугирование препаративное

В препаративных опытах. Необходимо учитывать также возможные изменения плотности среды. Однако плотность в меньшей мере зависит от температуры, чем вязкость. Ниже мы укажем и на другие параметры, которыми препаративный опыт может отличаться от аналитического, но в первую очередь необходим оптимальный учет изменений плотности и вязкости среды. Эти величины легко определить или найти из таблиц. Такого рода таблицы сведены вместе в прекрасном обзоре де Дюве и сотр. [4], посвященном градиентному центрифугированию клеточных компонентов. В значительной мере благодаря этому обзору препаративное ультрацентрифугирование перестало быть искусством и стало точной дисциплиной. В табл. 4 приведена часть данных из обзора де Дюве [4], позволяющих в сочетании с уравнение (IX. 3) учитывать эффекты, которые могут возникнуть при переходе от обычного буферного раствора к раствору с сахарозой при той или иной температуре. [c.175]

Ультрацентрифугирование. В ультрацентрифугах при ускорениях порядка 100 000—500000 g происходит довольно быстрое осаждение подавляющего большинства белков. Скорость осаждения зависит преимущественно от молекулярного веса белка. Теория ультрацентрифугирования белков и приложения этого метода для исследований размера и формы белковой молекулы будут рассмотрены в гл. VI. Здесь отметим только, что метод может быть использован и в препаративных целях. Теоретически эффективность такого разделения должна быть значительной. На практике, однако, возникают труднопреодолимые препятствия. Максимальная дистанция, которую проходят белки в кювете ультрацентрифуги, невелика, в результате чего удается обособить лишь крайние фракции. Нелегко предотвратить перемешивание участков жидкости в кювете при остановке центрифуги. Для этого прибегают, например, к разде- [c.21]

В этой ситуации книга Т. Боуэна заслуживает большого внимания. В ней в довольно сжатой форме описаны принципы основных методов аналитического и препаративного ультрацентрифугирования и показаны возможности их применения для изучения белков, [c.5]

Аналитическое ультрацентрифугирование полимеров [1, 2, 4, 12] включает в себя три следующих экспериментальных метода скоростную седиментацию, изучение седиментационного равновесия и процесса приближения к нему. Скоростная седиментация позволяет определить константу седиментации и полидисперсность образца. Седиментация макромолекул в зоне (зонное ультрацентрифугирование) — ценный метод обнаружения гетерогенности высокомолекулярного образца. Метод приближения к равновесию позволяет рассчитать молекулярную массу М и получить сведения о неоднородности полимера, а изучение седиментационного равновесия (состояния, достигаемого транспортным переносом макромолекул, хотя сам метод и не является истинно транспортным) — молекулярную массу (надежнее, но с большей затратой времени, чем в предыдущем методе) различных типов усреднения. Метод центрифугирования в градиенте плотности заключается в исследовании седиментации, состояния равновесия и приближения к нему в условиях искусственно создаваемого в кювете градиента плотности это — широко используемый метод определения молекулярной массы, наличия неоднородности и ее типа, служащий и для препаративных разделительных целей. [c.14]

Различают аналитические и препаративные ультрацентрифуги. Аналитические ультрацентрифуги имеют оптическую систему, которая позволяет регистрировать на фотопленках результаты ультрацентрифугирования. В аналитических ультрацентрифугах производится также определение констант седиментации частиц, что позволяет затем рассчитывать их молекулярные веса. [c.125]

Рис. 8.19. Различные варианты препаративного ультрацентрифугирования.

Препаративное ультрацентрифугирование используется для разделения веществ, различающихся по молекулярному весу, и особенно эффективно для разделения макромолекул с плотной упаковкой, например биополимеров. Существуют три разновидности препаративного ультрацентрифугирования [c.129]

Ультрацентрифугирование. Как и электрофорез, ультрацентрифугирование сравнительно редко используется для препаративного выделения [c.487]

ВЫХ оснований или нуклеотидов, полученных после расщепления полимера (подробнее — см. стр. 58). С нуклеотидным составом ДНК однозначно связаны два физических свойства двухцепочечных комплексов, которые часто используются для характеристики полученных препаратов 2 . 2в Одно из них — так называемая температура плавления Гщ — это температура, при которой происходит распад двухцепочечного комплекса на одноцепочечные молекулы этот процесс легко наблюдать по изменению УФ-поглощения или оптического вращения раствора (подробнее см. в гл. 4). Другая характерная константа ДНК — плавучая плотность р — может быть определена из результатов равновесного ультрацентрифугирования Такое центрифугирование проводят обычно в растворах солей, обладающих высокой плотностью чаще всего применяют хлорид или сульфат цезия. При длительном центрифугировании устанавливается градиент плотности раствора, а ДНК собирается в узкой зоне, где существует равновесие между центробежной силой и выталкивающей силой, которая определяется разностью плотности осаждаемого вещества и применяемого солевого раствора в данной зоне. Равновесное центрифугирование в градиенте плотности Сз С1 может служить не только аналитическим методом для характеристики препарата ДНК, но и полезным препаративным методом для разделения ДНК, различающихся по нуклеотидному составу. Подобным же образом препаративное ультрацентрифугирование в градиенте плотности сахарозы используется для разделения молекул ДНК, различающихся по скорости седиментации. [c.31]

Фракционирование по молекулярным весам может быть как аналитическим, так и препаративным. Цель аналитического фракционирования заключается в нахождении молекулярновесового распределения исследуемого образца. Полученную кривую распределения можно далее сопоставить с другими характеристиками образца, например с методом синтеза или способом деструкции этого полимера, с физическими и механическими свойствами его. Выделение и характеристика каждой отдельной фракции, что является самой длительной и трудоемкой частью эксперимента, проводится только для того, чтобы построить кривую раснределения. С целью упрощения аналитического фракционирования широко применяются методы турбидиметрического титрования, ультрацентрифугирования и фильтрования через гель. Такие методы можно применять для получения кривых распределения по молекулярным весам, не выделяя каждую фракцию. Подробно указанные методы рассматриваются в других главах. Современный уровень знаний, однако, не позволяет применять большинство подобных методов без калибровки по аналитическому фракционированию с выделением каждой фракции и определением хотя бы молекулярного веса их. [c.61]

Здесь будут рассмотрены только те варианты электрофореза, которые пригодны для разделения существенных количеств белковых смесей с выделением отдельных фракций. Применение для этой цели свободного электрофореза в растворе без каких-либо опорных сред затруднено теми же обстоятельствами, что и препаративное ультрацентрифугирование. При попытке выделить ту зону раствора, где расположена та или иная фракция, легко возникают токи жидкости, размывающие границы и перемешивающие содержимое различных зон. Предлагалось немало методических приемов для преодоления этого препятствия. Так, например, на определенной стадии процесса часть кюветы отсекали вдвигающейся стеклянной пластинкой. Применялись также пористые перегородки, не препятствующие движению белковых частиц, но предотвращающие смешивание при отборе части содержимого кюветы. Эти и другие аналогичные приемы не получили широкого распространения. Причина этого прежде всего в том, что они позволяют получать в чистом виде только фракции, занимающие в кювете крайние положения. Кроме того, производительность этих методов относительно невелика, а необходимое оборудование довольно дорого и сложно в эксплуатации. [c.30]

Заключительная оценка полноты очистки и гомогенности белка требует сочетания ряда применяемых методов. Для предварительного вывода о гомогенности необходимы прежде всего данные о невозможности дальнейшего фракционирования препарата всеми применимыми в данном случае методами. Разумеется, имеются в виду не все возможные приемы, а наиболее эффективные варианты основных методов фракционирования— ультрацентрифугирования, электрофореза, хроматографии, молекулярной фильтрации и др., причем не в препаративных, а в аналитических модификациях. При этом приходится считаться с опасностью того, что выявление, новых фракций может быть обусловлено частичной денатурацией белка при некоторых из этих процедур. С другой стороны, невозможность дальнейшего фракционирования может быть обусловлена недостаточным совершенством использованных разновидностей методов разделения. Нередко оказывалось, что применение более совершенных методов позволяло фракционировать белки, считавшиеся ранее гомогенными. [c.35]

Очень компактное и вместе с тем полное руководство по применению ультрацентрифугирования в современных биологических исследованиях. После краткого исторического обзора и описания наиболее распространенных ультрацентрифуг автор последовательно рассматривает принципы и возможности оптических систем, используемых в аналитических центрифугах, способы измерения коэффициентов седиментации и диффузии, важнейшие методы определения молекулярной массы, основы количественного анализа смесей, а также методы препаративного ультрацентрифугирования. [c.4]

Вот уже на протяжении почти полувека ультрацентрифуга широко используется при изучении полимеров. С течением времени ее значение непрерывно возрастает. Биологи широко используют ультрацентрифугу для препаративных и аналитических целей, поскольку она дает возможность, расходуя очень небольшие количества вещества, определять многие его параметры и осуществлять очень тонкое фракционирование. Ультрацентрифугирование служит интересам специалистов самых различных областей. Так, биофизики с помощью ультрацентрифуги исследуют свойства взаимодействующих систем и используют вычислительную технику для решения соответствующих математических уравнений, когда-то слишком трудных для решения. Что же касается биологов, то благодаря ультрацентрифуге они получили возможность быстро решать вопрос о чистоте и размерах молекул только что выделенных активных препаратов. [c.13]

Препаративное ультрацентрифугирование наиболее часто используют для выделения активных частиц из некоторой смеси биологического происхождения. Например, биохимик, располагая грязным препаратом фермента, стремится очистить его от примесей. Существует много методов, с помощью которых можно решить эту задачу, но здесь мы рассмотрим лишь фракционирование в центробежном поле. Допустим, что седиментационная диаграмма анализируемой смеси имеет несколько [c.179]

Для определения плавучей плотности анализируемых частиц можно использовать центрифугирование в градиенте плотности. В этом случае после установления равновесия изучаемые частицы оказываются на том уровне, на котором их плотность и плотность раствора совпадают. Если плотность вещества несколько превышает единицу (например, для липопротеида, рч = = 1,02 г/мл), то его целесообразно сконцентрировать около мениска препаративным ультрацентрифугированием (не градиентным) в буферном растворе с плотностью, скажем, 1,15 г/мл, доведенной до такого значе- [c.180]

Если коэффициенты седиментации компонентов отличаются сильно (скажем, в три раза и больше), то хорошее разделение достигается при ультрацентрифугировании в угловом роторе. Оно широко применяется на первых этапах фракционирования при больших объемах исходного раствора. Для лучшего разделения часто проводят повторное фракционирование. Когда величина коэффициента седиментации, скорректированная в соответствии с условиями препаративного эксперимента, примерно известна, возникает вопрос о выборе ротора, скорости и длительности вращения. Тротман [15] [c.189]

Индивидуальные рРНК в препаративных кол-вах получают из изолнр. субчастиц рибосом или ультрацентрифугированием суммарной РНК в градиенте концентрации сахарозы. Для аналит. целей индивидуальные рРНК м.б. получены с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. [c.266]

Вторая задача, которую нужно решить при количественной оценке результатов ЭХ нефтепродуктов, - это построение калибровочной кривой связывающей объем элюирования с размером (массой) молекул. Для уста новления соотношения между этими показателями ишользуют в основном три пути определение обьема элюирования эталонных соединений с извест ной молекулярной массой определение объема элюирования и молекуляр ной массы узких фракций, препаративно вьщелеш1ых методами ЭХ, ЖАХ или другими методами сравнение молекулярно-массового распределения полученного эксклюзионной хроматографией и другим методом, например ультрацентрифугированием. В качестве калибровочных параметров разме ров молекул используют обычно длину молекул, молекулярный объем молекулярную массу или гидродинамический обьем молекул. [c.83]

Для препаративного фракционирования лигнинов использовали электродиализ, ступенчатое извлечение из древесины, ступенчатое осаждение из растворов, элюирование из хроматографических колонок, а для аналитического фракционирования - ультрацентрифугирование, турбиди-метрическое титрование и эксклюзионную жидкостную хроматографию. При изучении молекулярно-массовых характеристик препаратов лигнина привлекались практически все методы определения молекулярной массы полимеров. [c.413]

Для экспериментального нахождения кривых ММР могут быть использованы> практически все методы препаративного фракционирования полимеров, позволяющие оценить молекулярную массу фракций, а также ряд транспортных методов — аналитическое ультрацентрифугирование, поступательная диффузия, экклюзион-ная хроматография, подробно описанные в литературе (см., например, [75]). [c.41]

Еще один способ калибровки состоит в построении интегральной кривой распределения массы в зависимости от объема элюирования (по данным ЭХ) и такой же кривой распределения массы в зависимости от молекулярной массы (по данным ультрацентрифугирования) [79]. Переход от одной кривой к другой позволяет получить соотношение между молекулярной массой и объемом элюирования (рис. 29). Интерпретация ряда кривых такого rana, полученных для разных асфальтенов, экстрактов асфальтенов, фракций битумов, вьщеленных препаративно методами ЭХ и ЖАХ, привела к единой калибровочной кривой для тяжелых фракций. Нижнюю часть этой кр ой, в области молекулярных масс менее 4000— 5000, нельзя получить ультрацентрифугированием. Здесь на помощь приходят парофазная осмОметрия и логарифмически нормальное распределение фракций по молекулярным массам, определенным парофазной осмометрией. Это помогает заверишть построение калибровочной кривой по всей области молекулярных масс. [c.85]

РНК рибосом обзоры — см. >22-125) Большая часть РНК живой клетки сосредоточена в цитоплазме и локализована в рибо-нуклеопротеидных гранулах, называемых рибосомами. Эти гранулы могут находиться в цитоплазме в свободном состоянии в клетках животных и растений они обычно связаны с мембранами эндоплазматической сети, образуя так называемый шероховатый эндоплазматический ретикулум . Рибосомы могут быть препаративно выделены ультрацентрифугированием и использованы в качестве исходного объекта для получения рибосомальной РНК- [c.37]

Впервые идея о применении значительной центробежной силы для осаждения и определения размеров коллоидных частиц была высказана и опробована на практике еще в 1913 г. Думан-ским. Однако потребовались долгие годы теоретических и практических изысканий, прежде чем Сведбергрм (1940 г.) были разработаны теоретические основы данного метода и создана первая ультрацентрифуга со скоростью вращения ротора до 65 ООО об1мин. К настоящему времени методы аналитического и препаративного ультрацентрифугирования получили широкое применение в исследованиях белков и нуклеиновых кислот и при изучении структурных элементов клетки. [c.142]

В 1961 г. в журнале Nature были опубликованы работы двух групп авторов, сыгравшие исключительную роль в формировании современных представлений о процессах биосинтеза белка. В обоих случаях было использовано препаративное ультрацентрифугирование в одном из них компоненты бесклеточнои системы разделяли в градиенте плотности хлористого цезия, в другом использовали градиенты концентрации сахарозы. [c.8]

При описанном выше ультрацентрифугировании пики, наблюдаемые при помощи шлирен-системы, отвечают границам между раствором и растворителем. Первые, быстрые пики отвечают компонентам, движущимся в окружении более медленных компонентов (фиг. 8). В биохимических смесях некоторые из этих медленных компонентов (например, рибосомы при анализе бактериального экстракта) создают большую вязкость. Измеряемые коэффициенты седиментации могут при этом очень сильно отличаться от приведенного к стандартным условиям значения Поэтому полученные при помощи скоростной седиментации значения s не всегда можно непосредственно использовать при планировании и анализе данных препаративного зонального центрифугирования в градиентах плотности. При зональном ультрацентрифугировании анализируемая смесь наносится в виде слоя на раствор с увеличивающейся по направлению ко дну плотностью (что предотвращает конвекционное перемешивание) и различные компоненты седиментируют в градиенте плотности в виде отдельных зон. Для наслоения смеси можно использовать специальную аналитическую ячейку, в которой техника наслоения принципиально не отличается от обычного препаративного наслоения на градиент. Одна из таких ячеек (Be kman Instruments In .) приведена на фиг. 15. Преимущества применения такой ячейки, как отмечают Виноград и Брунер [11], состоят в том, что она требует меньше исследуемого материала, анализируемые компоненты в ней пространственно разобщены, медленные примеси отстают от быстрее движущихся зон и седиментацию последних можно осуществлять в любом растворителе, не прибегая к предварительному диализу. Растворитель должен быть более плотным по сравнению с [c.67]