Аффинное осаждение

В случае хранения в замороженном состоянии при —20 °С рекомендуется разделять антисыворотку на партии небольших объемов, чтобы не подвергать ее многократному замораживанию и размораживанию. При использовании некоторых методов необходимо, чтобы иммуноглобулины IgG были отделены от других сывороточных белков. Осаждение сульфатом аммония или комбинирование этой операции с ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе [31, 36] или с аффинной хроматографией при использовании белка А, иммобилизованного на носителе [48], позволяет легко, но более или менее тщательно очистить эти иммуноглобулины. Иммуноаффинная хроматография, используя очищенный иммобилизованный антиген, дает возможность производить очистку специфических антител белка при разделении фракции IgG или даже антисыворотки. [c.97]

Поверхности, способные к биоспецифическому взаимодействию с компонентами крови Введение на поверхность, контактирующую с кровью, фрагментов, способных аффинно взаимодействовать с ее компонентами, может принципиально влиять на процесс осаждения этих компонентов. [c.67]

Часто аффинную хроматографию с успехом применяют на завершающем этапе выделения после частичной очистки с помощью менее специфических рутинных методов, например осаждения сульфатом аммония, гель-фильтрации и ионообменной хроматографии. Специфическое элюирование целевого продукта в этом случае может служить критерием его чистоты, а также тестом на сохранение биологической активности. [c.181]

Количество цельной сыворотки, которое удается разделить в препаративном ИЭФ, весьма незначительно из-за избытка альбумина. Не следует наносить более 10—20 мг сывороточных белков при фокусировании в широком диапазоне pH и 80—100 мг — в узком диапазоне. Поэтому лучше предварительно очистить антитела, например, путем осаждения сульфатом аммония, препаративным электрофорезом в блоке агарозы, аффинной хроматографией или комбинацией этих методов (см. гл. 2). [c.141]

Небольшие количества органического растворителя (например, до 10% по объему) практически не оказывают влияния на результаты фракционирования другими методами. Исключение составляют методы гидрофобной хроматографии (разд. 4.8) и аффинной адсорбции, зависящие от гидрофобных взаимодействий (разд. 4.5), а также часто фракционирование с помощью высаливания. Если фермент относительно стабилен к действию растворителя, фракционирование сульфатом аммония можно проводить в присутствии растворителя. Однако концентрация соли, необходимая для осаждения белка, будет при этом, вероятно, несколько выше, что обусловлено присутствием молекул органического растворителя, препятствующих гидрофобной агрегации белка при высокой концентрации соли. Излишки рас- [c.79]

Описанный метод получил дальнейшее развитие, и на его основе был разработан прием аффинной хроматографии [122], который сводится к тому, что в буферный раствор добавляют лиганд, изменяющий адсорбционные характеристики. Будь то гидрофобные адсорбенты или агароза, принципы аффинной хроматографии остаются теми же, что и в случае использования более специфических адсорбентов (разд. 4.5) или ионообменников (разд. 4.4). Сначала в отсутствие лиганда находят условия, которых еще не вполне достаточно, чтобы вызвать нужный эффект (в данном случае элюцию). Затем добавляют лиганд, что слегка нарушает установившееся равновесие и приводит к ожидаемому эффекту. Важно, чтобы при добавлении лиганда происходило заметное изменение существенного для очистки свойства, в данном случае — гидрофобного взаимодействия. Лиганд должен сохранять способность связываться с ферментом в условиях, существующих в колонке, т. е. при высокой концентрации соли. Примером аффинного осаждения может служить очистка некоторых тРНК-аминотрансфераз [122] связывание крупной молекулы тРНК приводит к заметному снижению адсорбционной способности колонки, что позволяет осуществлять элюирование. [c.187]

Смит II соавторы с помощью аффинной хроматографии очищали рецептор прогестерона человека. Содержание рецептора в матке составляет лишь 0,002% суммарного белка, и оп весьма лабилен. В качестве лиганда использовали 11-дезоксикортикостерон. Гормон сажали на Br N-активнрованную сефарозу 41 в виде конъюгата с бычьим сывороточным альбумином. Полученный таким образом аффинный сорбент инкубировали 18 ч с частично очищенным цитозолем матки, промывали 0,4 М КС1 и элюировали мкМ раствором меченного тритием прогестерона. Рецептор выходил в комплексе с гормоном. Операция обеспечивала очистку в 10 ООО раз. Вместе с предварительной 6-кратной очисткой цитозоля осаждением сульфатом аммония это позволило авторам получить гомогенный препарат рецептора [Smith et al., 1981). [c.434]

Выделение. Одии из первых этапов выделения Б,-получение соответствующих органелл (рибосом, митохондрий, ядер, цитоплазматич. мембраны) с помощью дифференциального центрифугирования. Далее Ь переводят в растворимое состояние путем экстракции буферными р-рами солей и детергентов, иногда-неполярными р-рителями. Затем применяют фракционное осаждение неорг. солями [обычно (N 14)2804], этанолом, ацетоном или путем изменения pH, ионной силы, т-ры. Для предотвращения денатурации работу проводят при пониж. т-ре (ок. 4°С) с целью исключения протеолиза используют ингибиторы протеаз, нек-рые Б. стабилизируют полиоламн, иапр. глицерином. Дальнейшую очистку проводят по схемам, специально разработанным для отдельных Б. илн группы гомологичных Б. Наиб, распространенные методы разделения-гель-про-никающая хроматография, ионообменная и адсорбц. хроматография эффективные методы-жидкостная хроматография высокого разрешения и аффинная хроматография. [c.250]

Фракционное осаждение сульфатом аммония, аффинная хроматография на порошковой целлюлозе, хроматография на ДЕАЕ-сефадексе, сефакриле 3-200 [c.124]

Отсюда следует, что, поскольку между ингибитором и ферментом образуется связь, в целом процесс очистки следует рассматривать скорее как осаждение, а не как хроматографию. Это может быть продемонстрировано изотермой адсорбции для аффинной хроматографии, приведенной на рис. 5.1 суммарная изотерма адсорбции (5) может быть определена как сумма изотерм специфической (1) и неспецифической (2) адсорбции. Специфическая изотерма адсорбции характеризует идеальную специфическую сорбцию с постоянной и относительно высокой адсорбционной энергией АО для всех адсорбируемых частиц. Сорбция прекращается, когда все доступные аффинантные центры заняты. [c.63]

Моноклональные антитела класса IgG обычно содержат 10—12% углеводов и могут быть очищены аффинной хроматографией на лектнне из чечевицы, иммобилизованном на сефарозе. Для этого на колонку с сорбентом наносят иммуноглобулины после солевого осаждения, предварительно отднализованиые [c.51]

Следует помнить о емкости каждого метода методы осаждения особенно подходят для первого этапа, так как они позволяют работать с очень большим количеством материала. Гель-фильтрация характеризуется умеренной емкостью, если нет возможности использовать колонки огромных размеров. Аффин- ной адсорбции свойственна низкая емкость, однако этот метод позволяет об,работать (большое количество белка, если фактически адсорбируется лишь незначительная его доля. Обессоливание , которое можно провести очень быстро, применяется в следующих удобных для практического использования схемах [c.268]

Выделяют ферменты так же, как и другие белки, хотя есть приемы, применяемые преимущественно для ферментов. Из них можно отметить экстракцию глицерином, в котором сохраняются нативные свойства ферментов, а также метод ацетоновых порошков, состоящий в осаждении и быстром обезвоживании при температуре не выше —10° С тканей или вытяжек из них, содержащих ферменты. К их числу относится также получение ферментов путем адсорбции с последующей элюцией (снятием) с адсорбента. Этот метод был введен в химию ферментов А. Я. Данилевским и дал мощный толчок развитию ферментологии. Сейчас адсорбционный метод вьщеления и очистки ферментов разработан детально. Наряду с ним широко применяют метод ионообменной хроматографии, метод молекулярных сит. электрофорез и особенно изоэлектрофокусирование. Oiona из остроумнейших модификаций адсорбционного метода—аффинная хроматография, где адсорбентом служит вещество, с которым фермент взаимодействует избирательно. В результате лишь один этот фермент задерживается на колонке, а все сопутствующие ему выходят с током проявителя. Изменяя характер проявителя, исследуемый фермент элюируют с колонки. Этим методом достигают очистки фермента в несколько тысяч раз, применяя всего лишь одноэтапную (аффинная сорбция—элюция) схему выделения. [c.97]

Структура антител. Белки иммуноглобулинов по химическому составу относятся к гликопротеидам, так как состоят из протеина и сахаров построены из 18 аминокислот. Имеют видовые отличия, связанные главным образом с набором аминокислот. Молекулярная масса иммуноглобулинов находится в пределах 150—900 кД. Их молекулы имеют цилиндрическую форму, они видны в электронном микроскопе. До 80 % иммуноглобулинов имеют константу седиментации 7S устойчивы к слабым кислотам, щелочам, нагреванию до 60 °С. Вьщелить иммуноглобулины из сыворотки крови можно физическими и химическими методами (электрофорез, изоэлектрическое осаждение спиртом и кислотами, высаливание, аффинная хроматография и др.). Эти методы используют в производстве при приготовлении иммунобиологических препаратов. [c.149]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология