Аффинная адсорбция хроматография

Преимуществом колоночной хроматографии является возможность количественного фракционирования больших количеств веществ без превращения их в какие-либо производные. Однако хорошее разделение часто возможно лишь при малых скоростях элюирования, поэтому были разработаны новые виды колоночной хроматографии. Методы аффинной и адсорбционной хроматографии основаны на избирательной адсорбции молекул на нерастворимом адсорбенте, который содержит группы (молекулы), специфически взаимодействующие с молекулами подлежащих очистке соединений, например ингибиторы (для очистки ферментов) или антитела (для очистки антигенов) в настоящее время эти методы нашли широкое применение и для разделения углеводов. Невзаимодействующие с адсорбентом примеси удаляются, а связанный с адсорбентом сахар затем десорбируют способом, не приводящим к его разрушению. Десорбцию можно осуществить, изменяя pH, ионную силу среды или применяя соответствующий ингибитор взаимодействия, удерживающего вещество на адсорбенте. Для разделения ряда полисахаридов были использованы иммобилизованные формы (см. разд. 26.3.7.6) конканавалина А [40], являющегося фитогемагглютинином (лектином), который специфически взаимодействует с разветвленными полисахаридами определенного строения в настоящее время применяют и другие иммобилизованные фитогемагглютинины. Колоночная хроматография на носителях, покрытых полиароматическими соединениями [41], также находит применение для разделения полисахаридов. Благодаря достижениям в производстве носителей для жидкостной хроматографии под высоким давлением можно осуществить хроматографическое разделение быстро и избирательно описаны методы фракционирования небольших олигосахаридов, продолжающегося менее 1 ч [42]. [c.224]

Небольшие количества органического растворителя (например, до 10% по объему) практически не оказывают влияния на результаты фракционирования другими методами. Исключение составляют методы гидрофобной хроматографии (разд. 4.8) и аффинной адсорбции, зависящие от гидрофобных взаимодействий (разд. 4.5), а также часто фракционирование с помощью высаливания. Если фермент относительно стабилен к действию растворителя, фракционирование сульфатом аммония можно проводить в присутствии растворителя. Однако концентрация соли, необходимая для осаждения белка, будет при этом, вероятно, несколько выше, что обусловлено присутствием молекул органического растворителя, препятствующих гидрофобной агрегации белка при высокой концентрации соли. Излишки рас- [c.79]

Большинство исследователей под аффинной хроматографией понимают использование иммобилизованного на адсорбенте лиганда, осуществляющего специфический отбор связывающихся с этим лигандом белков (разд. 4.5). После адсорбции фермент может быть элюирован либо неспецифическим образом, например, путем повышения концентрации соли, либо специфическим в результате замещения белка свободным лигандом в растворе. Следовательно, аффинная хроматография может включать две специфические стадии — аффинную адсорбцию и аффинную элюцию . Механизм элюции со специфического адсорбента достаточно ясен. С практической точки зрения присутствие лиганда снижает коэффициент распределения с 1,0 до значитель- [c.133]

Приложение теории хроматографии к аффинной адсорбции [c.153]

Несколько неожиданным результатом является то, что для хорошей адсорбции (а>0,9) величина Кр должна быть ниже 0,001 мМ или 10 М, т. е. меньше, чем обычные константы диссоциации для комплексов белок—лиганд. Если учесть, что специфическое взаимодействие белка с иммобилизованным в колонке лигандом, вероятно, слабее, чем его взаимодействие со свободным лигандом, то естественно возникает вопрос, каким же образом осуществляется аффинная адсорбционная хроматография. [c.153]

Помимо аффинной хроматографии (которая иногда называется еще аффинной адсорбцией в геле) в крупномасштабных биотехнологических процессах для очистки продуктов все шире применяют аффинную преципитацию и аффинное разделение. [c.73]

Весьма важное место принадлежит аффинной хроматографии [116, 117]. Она основана на использовании особых адсорбентов, специфически взаимодействующих с макромолекулами и избирательно удерживающих данный вид макромолекул (отсюда и название метода). Примером, о котором уже говорилось в разд. Г.10, служит адсорбция комплементарных фрагментов молекулы нуклеиновой кислоты на иммобилизованной ДНК. Аффинная хроматография используется также для очистки ферментов, антител и других белков, способных прочно связываться со специфическими малыми молекулами. [c.161]

Белки обычно избирательно адсорбируются на твердых фазах самых разных типов. Поэтому адсорбционные методы, особенно колоночная хроматография, широко используются для разделения белков. Применение таких методов часто позволяет получить наибольшую степень очистки белков, что в случае фе рментов означает максимально возможное повышение их удельной активности. Хотя колоночная хроматография служит идеальным способом оптимального разделения белков, не следует забывать и о методах адсорбции в объеме , так как это очень быстрые и потому весьма полезные методы, когда время имеет первостепенное значение (см. также гл. 7). Важнейшими адсорбентами белков являются ионообменники, фосфат кальция (в виде геля или в кристаллической форме) и разнообразные аффинные адсорбенты, созданные для ферментов определенных типов. Все эти вопросы вслед за общим введением в теорию адсорбционной хроматографии обсуждаются в данной главе применительно к выделению белков. [c.91]

Рис. 5.1. Изотерма адсорбции для аффинной хроматографии.

Условия проведения аффинной хроматографии зависят от природы соединения, которое нужно выделить. Однако существует ряд общих требований, касающихся свойств нерастворимого носителя, выбора типа аффинного лиганда, его связывания с носителем, условий адсорбции и элюирования. [c.7]

Необратимость взаимодействия клеток с аффинным носителем хотя адсорбция клеток на специфических иммобилизованных лигандах зачастую достигается легко, постоянно возникали трудности при последующем выделении связавшихся клеток с применением методов, совместимых с жизнеспособностью клеток. Одна из причин этих трудностей — многоточечное связывание между клеткой и носителем каждая клетка обладает многочисленными рецепторами для иммобилизованного лиганда, причем несколько молекул лиганда сами связаны с одной и той же частицей матрицы или поверхности. Второй причиной необратимого связывания клеток с аффинным носителем может быть очень высокое сродство между иммобилизованным лигандом и его рецептором на поверхности клетки, которое часто возникает, если узнавание клетки и лиганда основано на взаимодействии антиген — антитело это весьма серьезное ограничение при выделении жизнеспособных клеток иммуноаффинной хроматографией. [c.247]

В отношении ионообменной хроматографии важно отметить еще несколько моментов. Хотя, согласно простым теориям, условия элюции прямо противоположны условиям адсорбции, на практике часто наблюдается гистерезис. Особенно это характерно для фосфоцеллюлозы, но отмечается также и при работе с другими адсорбентами, такими, как аффинные и модифицированные красителем лигандные адсорбенты (разд. 4.5 и 4.6). Гистерезис означает, например, что величина а, наблюдающаяся при использовании в процессе адсорбции того или иного буфера с определенной ионной силой, будет отличаться от величины а, когда тот же буфер используют для элюции. Так, на рис. 4.21 ионная сила А вполне достаточна для адсорбции, тогда как ионная сила В мала для элюции и слишком велика для адсорбции. Эти эффекты можно объяснить тем, что данные процессы неидеальны и неравновесны кроме того, здесь действуют и другие факторы, не учитываемые простой теорией. [c.132]

Чтобы не путать с предыдущим разделом, этот раздел, в котором описано то, что обычно понимается под названием аф- финная хроматография , озаглавлен Аффинная адсорбционная хроматография . В этом случае биоспецифический отбор происходит на стадии адсорбции, так как выделяемый белок обладает специфическим сродством к адсорбенту благодаря его способности связывать лиганд (рис. 4.32). Нет четкого разделения между действительно специфическими аффинными адсорбентами, которые кроме белков, имеющих центры связывания для иммобилизованного лиганда, связывают мало других белков, и адсорбентами общего типа, которые хотя и проявляют специфичность к определенным классам белков, связывают также и многие другие. Описание адсорбентов второго типа можно начать сокращенных адсорбентов, обладающих значительной избирательностью к ферментам, имеющим нуклеотидсвязывающие центры, а затем перейти к таким адсорбентам, как фосфоцеллюлоза, которая, будучи в основном ионообменником, часто используется в качестве псевдоаффинного носителя для белков, связывающих нуклеиновые кислоты [70], и ферментов, взаимодействующих с фосфорилированными сахарами [62, 63]. Хотя [c.146]

В ходе создания носителей для аффинной хроматографии было проведено множество контрольных опытов, в частности изучено поведение матриц, содержащих удлиняющие мостики без лиганда. В большинстве случаев, как и следовало ожидать, адсорбции на таких носителях не отмечалось. Однако в некоторых случаях было обнаружено, что ферменты прочно связывались с гексаметиленовыми мостиками , даже если они не содержали заряженных концевых аминогрупп или карбоксильных групп, которые могли бы функционировать как ионообменники [115]. Эти наблюдения послужили отправным пунктом для развития методов гидрофобной хроматографии, основанных [c.182]

ЮТСЯ к активированной агарозе. Агароза, к которой привязан белок — ингибитор трипсина, выделяемый из соевых бобов, является превосходным специфическим адсорбентом трипсина и химотрипсина (рис. 5.21). Оба фермента связываются с этим ингибитором в соке поджелудочной железы в условиях их каталитической активности, поэтому очень вероятно, что взаимодействие с ингибитором происходит специфически. В аффинной хроматографии адсорбцию белков обычно осуществляют в условиях, благоприятствующих максимальному специфическому связыванию. После того как большинство белков сока поджелудочной железы выйдет, не задерживаясь, из колонки, химотрипсин специфически элюируют буферным раствором, содержащим ингибитор этого фермента — триптамин. Затем раствором, содержащим бензамидин (ингибитор трипсина, но не химотрипсина), элюируют трипсин. Триптамин и бензамидин являются специфическими десорбентами этих ферментов, поскольку они также связываются с их активными центрами и, следовательно, способны вытеснять оттуда соевый ингибитор трипсина. Привязывание белков к агарозе нашло широкое применение для выделения других белков например, специфические антитела на какой-либо белок-антиген адсорбируют на агарозе с привязанным антигеном, а затем десорбируют их, промывая колонку раствором с высокой ионной силой или низким pH. [c.160]

Адсорбция и элюция при аффинной хроматографии на колонке [c.103]

Выделение. Одии из первых этапов выделения Б,-получение соответствующих органелл (рибосом, митохондрий, ядер, цитоплазматич. мембраны) с помощью дифференциального центрифугирования. Далее Ь переводят в растворимое состояние путем экстракции буферными р-рами солей и детергентов, иногда-неполярными р-рителями. Затем применяют фракционное осаждение неорг. солями [обычно (N 14)2804], этанолом, ацетоном или путем изменения pH, ионной силы, т-ры. Для предотвращения денатурации работу проводят при пониж. т-ре (ок. 4°С) с целью исключения протеолиза используют ингибиторы протеаз, нек-рые Б. стабилизируют полиоламн, иапр. глицерином. Дальнейшую очистку проводят по схемам, специально разработанным для отдельных Б. илн группы гомологичных Б. Наиб, распространенные методы разделения-гель-про-никающая хроматография, ионообменная и адсорбц. хроматография эффективные методы-жидкостная хроматография высокого разрешения и аффинная хроматография. [c.250]

Ж. X. примен. для разделения и анализа р-ров в-в, имеющих небольшое давление насыщ. пара или неустойчивых при повышенных т-рах, а также для физ.-хим. исследований, напр, для определения констант Генри при адсорбции из р-ров. Миним. погрешность измерений составляет ок. 1%. Для разделения ионов металлов и неметаллов успешно использ. т. н. экстракц. хроматография, в к-рой неподвижной фазой служит орг. р-ритель (экстрагент), а недвижной — водные р-ры исследуемых соединений. К колоночной Ж. X. относятся также эксклюзионная хроматография, аффинная хроматография и ионообменная хроматография. Ж. X. предложил М. С. Цвет в 1903—06. [c.204]

В качестве аффинных лигандов можно использовать любые соединения, прочно, специфично и обратимо связывающиеся с выделяемым веществом. Химическое строение аффинных лигандов может быть самым различным. Поскольку в настоящее время метод аффинной хроматографии применяется главным образом для выделения ферментов и их ингибиторов [89J, мы рассмотрим примеры, взятые из этой области. Как уже упоминалось, при выделении фермента аффинными лигандам1И могут служить его ингибитор, аналогичный субстрату, а также эффектор, кофактор и в отдельных случаях даже субстрат. Это справедливо и для фермента, требующего длл реакции два субстрата, но способного достаточно сильно связываться только с одним из них. Субстрат также можно использовать для адсорбции фермента в таких условиях, когда фермент связывается, но сам не способен катализировать реакцию (например, в отсутствие ионов металлов, необходимых для реакции), а также когда константа Михаэлиса зависит от pH или температуры. Аффинный адсорбент для выделения белков обычно трудно получить из аффинного лиганда, если константа диссоциации его комплекса с белком превышает (0,5—1,0)-Ю [16]. Однако Стире и сотр. [84] показали, что очень эффективный адсорбент для р-галактозидазы можно получить даже из такого относительно слабого ингибитора, как н-аминофенил-р-о-тиогалактопирано-зид (/i , 5-10 ). Этого удается достигнуть, повышая концентрацию нерастворимого аффинного лиганда и увеличивая расстояние между аффинным лигандом и матрицей носителя, что приводит к максимальной доступности аффинного лиганда, для белка в растворе. [c.9]

По своему существу аффинная хроматография — это особый тип адсорбционной хроматографии. В отличие от того, что было описано в гл. 6, адсорбция здесь осуществляется за счет биоспецифп-ческого взаимодействия между молекулами, закрепленными на матрице, т. е. связанными в неподвижной фазе, и комплементарными к ним молекулами, подлежащими очистке или фракционированию, поступающими, а затем элюируемыми с подвижной фазой. Биоспеци-фическое взаимодействие отличается исключительной избирательностью, а зачастую и очень высокой степенью сродства между партнерами. Оно лежит в основе множества строго детерминированных процессов, протекающих в организме. В качестве примеров можно назвать взаимодействия между ферментами и их субстратами, кофакторами или ингибиторами, между гормонами и их рецепторами, между антигенами и специфическими для них антителами, между нуклеиновыми кислотами и специфическими белками, связывающимися с ними в процессе осуществления своих функций (полимераза.мп, нуклеазами, гистонами, регуляторными белками), а также между самими нуклеиновыми кислотами-матрицами и продуктами их транскрипции. Наконец, многие малые молекулы (витамины, жирные кнслоты и др.) специфически связываются со специальными транспортными белками. [c.339]

После удаления посторонних примесей промывкой состав элюента можно изменить таким образом, чтобы ослабить силу всех биоспе-цпфичесних взаимодействий. Равновесия адсорбции, первоначально очень сильно сдвинутые в сторону образования комплексов, могут измениться таким образом, что фракционируемые вещества начинают мигрировать по колонке с различной скоростью, что характерно для процесса динамической хроматографии. Однако этот вариант (аффинное хроматографическое фракционирование родственных веществ) на практике встречается значительно реже, чем статический [c.339]

Таким образом, в аффинной хроматографии используется нерастворимый носитель, на котором иммобилизуется соединение, называемое лигандом он особым образом связывает подлежащий очистке продукт, находящийся в подвижной, обычно жидкой фазе. Лиганд иммобилизуют на носителе чаще всего посредством ковалентных связей, но иногда пользуются другими возможностями, такими, как ионный обмен, адсорбция, микроинкапсулирование и пр. Аффинная хроматография — это своего рода адсорбционная хроматография, при которой связывание происходит в соответствии со специфическими свойствами двух молекул. Эти свойства обусловливают взаимодействия различного характера — ионные, водородные, гидрофобные и др. в зависимости от конформации и размера молекул (рис. 3.3). [c.80]

Создан противоточный реактор непрерывного действия для ферментативного гидролиза [1] В этом реакторе реализован ряд новых принципов Во-первых, рабочая зона колонного реактора плотно наполняется целлюлозой, чем достигается ее более высокая концентрация (до 40%) и более высокая объемная скорость гидролиза, чем в реакторах другого типа, например с перемешиванием Во-вторых, целлюлазы удерживаются на целлюлозе в реакторе за счет адсорбции по принципу аффинной хроматографии Это позволяет обойтись без специальных мембран, удерживающих ферменты в реакторе, что удешевляет процесс В-третьих, в таком реакторе можно использовать культуральные жидкости с достаточно низким содержанием целлюлазы, так как эти ферменты концентрируются в реакторе за счет адсорбции В-четвертых, протеазы и другие ферменты, инактивирующие целлюлазы, удаляются из реактора еще до начала гидролиза целлюлозы, поскольку они, как правило, адсорбируются на целлюлозе [c.211]

Однако термин аффинная хроматография вызывал (и все еще продолжает вызывать) много возражений. Делались попытки заменить его более точным например, биоспецифическая адсорбция или биоаффинная хроматография [29, 31], в особенности когда было найдено, что ряд сорбентов, в особенности такие, ко торые связываются с синтетическими ингибиторами своей гидро фобной углеводородной цепью, могут сорбировать макромолекуль в результате преимущественно гидрофобных взаимодействий [28] Использование комплексообразования биологических макромоле кул, основанного на гидрофобных взаимодействиях, положило на чало гидрофобной хроматографии [38]. Однако во многих слу чаях провести четкую границу между биоспецифическим комплексом и комплексом, образующимся в результате действия неспецифических гидрофобных взаимодействий, не так просто, как могло бы показаться на первый взгляд. Часто одно и то же вещество, привязанное к носителю, с одной группой макромолекул может образовывать биоспецифические комплексы, в то время как с другой оно может давать комплексы исключительно благодаря неспецифическим гидрофобным взаимодействиям, а в образовании [c.9]

Отсюда следует, что, поскольку между ингибитором и ферментом образуется связь, в целом процесс очистки следует рассматривать скорее как осаждение, а не как хроматографию. Это может быть продемонстрировано изотермой адсорбции для аффинной хроматографии, приведенной на рис. 5.1 суммарная изотерма адсорбции (5) может быть определена как сумма изотерм специфической (1) и неспецифической (2) адсорбции. Специфическая изотерма адсорбции характеризует идеальную специфическую сорбцию с постоянной и относительно высокой адсорбционной энергией АО для всех адсорбируемых частиц. Сорбция прекращается, когда все доступные аффинантные центры заняты. [c.63]

Однако иногда в неочищенном белке содержатся два или более фермента, обнаруживающих сродство к связанному аффинанту. Если константа равновесия реакции для второго фермента /(1(11) > 10" моль/л, то только незначительные количества второго фермента будут задерживаться на носителе вместе с выделяемым ферментом. Если 1(11) 10 моль/л, то собируется смесь обоих ферментов даже в том случае, если выделяемого фермента много меньше /< 1(11). Это следует из специфической формы изотермы адсорбции для аффинной хроматографии, поскольку теплота адсорбции предельно высока в условиях хроматографии. [c.63]

Ограниченные запасы витаминов и гормонов в- животных привели к развитию механизмов адсорбции, транспорта и консервации этих веществ в следовых количествах. В таких процессах важную роль играют специфические транспортные или связывающие белки, предотвращающие быстрое выведение витаминов и гормонов с мочой, которое происходило бы, если витамины и гормоны не были бы связаны в плазме в соответствующих комплексах. Связывающие белки присутствуют в очень низких концентрациях. Например, белки, прочно связывающие витамин В12, траноко баламины I и И, находятся в плазме крови человека в концентрациях соответственно 80 и 20 мг на 1000 л. Однако они обычно имеют высокое сродство к комплементарным витаминам и гормонам. Константы диссоциации этих комплексов находятся в интервале от 10 до 10 моль/л [35]. Из-за низких концентраций эти белки нельзя выделить классическими методами очистки наличие специфических взаимодействий с высоким сродством позволяет использовать аффинную хроматографию, которая допускает работу с большими объемами исходного материала. Как и для взаимодействий антитело — антиген, трудности заключаются в последующем выделении белка из комплекса с аффинными сорбентами. [c.124]

Прп.менение линейного градиента температуры для разделения смеси дрожжевой алгокольдегидрогеназы, глицерокиназы, гексоки-назы и лактатдегидрогеназы аффинной хроматографией на №-(6-аминогексил)-5 -АМР-сефарозе [15] показано на рис. 10.7. Интересно, что глицерокипаза и дрожжевая алкогольдегидрогеназа элюируются в порядке, предсказываемом на основе их наблюдаемых энергий адсорбции с высоким выходом (70—90%), в то время как лактатдегидрогеназа требует ударного элюирования 5 мМ [c.268]

Выявленные закономерности адсорбции целлюлаз на целлюлозе и поведения адсорбированных ферментов позволили сформулировать требования к конструкции реактора для ферментативного гидролиза целлюлозы и проверить их на практике. В результате были выработаны принципы создания противоточных ферментных реакторов для непрерывного гидролиза целлюлозы. Особенности действия подобных реакторов следующие. 1. Рабочая зона колонного реактора плотно набивается целлюлозой, этим достигаются ее более высокие концентрации (до 40—60%) и объемная скорость гидролиза, а отсюда и больший выход продукта реакции — глюкозы, чем в реакторах другого типа, например с перемешиванием. 2. Целлюлазы удерживаются на целлюлозе в реакторе за счет адсорбции по принципу аффинной хроматографии. Это позволяет обойтись без специальных мем- [c.41]

Предлагаемое вниманию советского читателя руководство вышло в серии книг, посвященных актуальным методам современной биохимии и родственных областей естествознания. В нем собраны подробные экспериментальные методики, охватывающие практически все аспекты аффинной хроматографии получение, характеристика и применение твердых носителей, активация твердых носителей, иммобилизация на них лигандов различной природы, адсорбция и элюирование, анализ биоспе-цифических адсорбентов, использование аффинной хроматографии в препаративном масштабе и в условиях высокоэффективной хроматографии, количественная характеристика молекулярных взаимодействий, выделение клеток и другие. Хотя как практическое руководство данная книга призвана помочь исследователю прежде всего в экспериментальной работе, каждой главе предпослано небольшое теоретическое вступление. Особую ценность книге придает участие в ее написании ведущих специалистов по аффинной хроматографии из многих стран. [c.5]

Для масштабной и быстрой очистки белков успешно применяются избирательная адсорбция и элюция белков с целлюлозного анионообменника диэтиламиноэтилцеллюзлозы и катионообменника карбоксиметилцеллюлозы. Широко используется также разделение белков по размерам на молекулярных ситах, например сефадексе. Эти методы являются, однако, относительно малоселективными (если они не используются в сочетании) для отделения индивидуального белка от всех остальных, находящихся в смеси. Такая задача легче решается методом аффинной хроматографии. [c.69]

Степень замещения — важный показатель при хроматографии на окрашенных сорбентах. Это справедливо и для других методов аффинной хроматографии. Если в связывании участвует не одна, а большее число молекул красителя, то этим достигается более прочная адсорбция (см. рис. 4.40). Кроме того, чем выше значение mt, тем больше оказывается а [уравнение (4.5)]. Иногда бывает так, что высокозамещеннын гель связывает нужный фермент так прочно, что последующий его выход оказывается очень низким. Б таком случае следует использовать менее замещенные гели, уменьшая время обработки геля красителем в ходе приготовления адсорбента. Для получения устойчивых результатов следует фиксировать степень замещения [98]. [c.169]

Выделяют ферменты так же, как и другие белки, хотя есть приемы, применяемые преимущественно для ферментов. Из них можно отметить экстракцию глицерином, в котором сохраняются нативные свойства ферментов, а также метод ацетоновых порошков, состоящий в осаждении и быстром обезвоживании при температуре не выше —10° С тканей или вытяжек из них, содержащих ферменты. К их числу относится также получение ферментов путем адсорбции с последующей элюцией (снятием) с адсорбента. Этот метод был введен в химию ферментов А. Я. Данилевским и дал мощный толчок развитию ферментологии. Сейчас адсорбционный метод вьщеления и очистки ферментов разработан детально. Наряду с ним широко применяют метод ионообменной хроматографии, метод молекулярных сит. электрофорез и особенно изоэлектрофокусирование. Oiona из остроумнейших модификаций адсорбционного метода—аффинная хроматография, где адсорбентом служит вещество, с которым фермент взаимодействует избирательно. В результате лишь один этот фермент задерживается на колонке, а все сопутствующие ему выходят с током проявителя. Изменяя характер проявителя, исследуемый фермент элюируют с колонки. Этим методом достигают очистки фермента в несколько тысяч раз, применяя всего лишь одноэтапную (аффинная сорбция—элюция) схему выделения. [c.97]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология