Сорбция аффинная

Разнообразные варианты хроматографии [1—4] укладываются в относительно простую схему классификации в зависимости от используемой подвижней фазы и характера межмолекулярных взаимодействий. Поскольку характер взаимодействий может быть очень различным от чисто ситового эффекта к физической сорбции и далее к хемосорбции (ионный обмен, аффинная хроматография), то почти не существует объектов, для разделения которых не удавалось бы найти подходящего сорбента и систем растворителей. Области применения основных вариантов хроматографии в зависимости от молекулярной массы исследуемых соединений показаны на рис. 1.1. [c.17]

Адсорбционную хроматографию на угле, крахмале и других классических сорбентах вообще не применяют для разделения пептидов. Этот метод представлен здесь аффинной хроматографией, основанной на биоспецифической сорбции. Правда, аффинную хроматографию в основном применяют при выделении белков, однако метод может оказаться полезным при изучении физиологически активных пептидов. [c.390]

Однако кажущаяся простота метода и отсутствие у новичка представления о возможных трудностях, сопровождающих его применение на практике, могут привести к обескураживающим неудачам. Действительно, трудно заранее предугадать, какой аффинный лиганд полезнее выбрать — с высоким или низким сродством, какова наиболее благоприятная концентрация этого лиганда в сорбенте, какую роль должна играть матрица, какие носители подходят и какие не подходят для иммобилизации аффинного лиганда. Например, отлично зарекомендовавшие себя с точки зрения иммобилизации ферментов носители на основе кремнезема оказываются в ряде случаев совершенно непригодными для использования в аффинной хроматографии из-за высокой неспецифической сорбции. [c.5]

Из сказанного выше видно, что в настоящее время термин аффинная хроматография распространяется не только на методы, основанные на образовании комплексов в результате строго био-специфических взаимодействий. Напротив, этот термин стал настолько широким, что используется также и для обозначения метода выделения биологических макромолекул путем простой сорбции па специфическом сорбенте (который часто бывает даже одноразового употребления). По-видимому, этит термин не совсем точен, но сегодня он общепринят. [c.10]

Сорбция, промывка и элюирование ферментов с использованием колоночной аффинной хроматографии описываются с помощью уравнений, выведенных для модели одноразовой сорбции и элюирования путем изменения Кь (рис. 3.7). Из рис. 3.7, а хорошо видно, что при /Сь=10 моль/л значительная потеря фермента (61,6%) происходит при промывках. Элюирование при Кь, равных [c.32]

Влияние температуры на сорбцию и элюирование выделяемых аффинной хроматогра( )ией веществ рассмотрено далее (гл. 10). В заключение этого раздела следует подчеркнуть, что всегда следует помнить о влиянии температуры, поскольку воспроизводимые результаты можно получить, только если температура тщательно контролируется особенно это касается аналитических приложений аффинной хроматографии. [c.89]

Специфичность методов аффинной хроматографии наряду с избирательной сорбцией кетоаминной фракции НЬ Ale на ПААГ определяется спектрофотометрической детекцией гема, имеющего максимальную величину оптической плотности при длине волны 415 нм. Это обстоятельство позволяет избежать искажения результатов анализа за счет присутствия других гликолизированных белков эритроцитов или плазмы крови. [c.67]

Аффинный сорбент с групповой специфичностью пмеет явное преимущество в том случае, когда ставится задача не только очистки, но и разделения нескольких веществ, наделенных сродством к одному и тому же лиганду. Если степень этого сродства не одинакова для разных веществ группы или если удается подобрать для них различные (специфические) конкурентные элюенты, то разделение веществ люжет быть осуществлено хроматографически, в ходе пх поочередной элюции с сорбента, что не удалось бы сделать в случае лиганда, обладающего сугубо индивидуальной специфичностью. С позиций очистки одного вещества это же положение дел можно сформулировать следующим образом снижение избирательности сорбции ири использовании сорбентов с групповой специфичностью часто удается компенсировать за счет избирательности аффинной конкурентной элюции. [c.363]

Перед использованием колонки с аффинным сорбентом ее имеет смысл промыть раствором бычьего сывороточного альбумина (2 мг/мл). Было замечено, что в результате этого улучшается качество очистки и фракционирования методом конкурентной элюции целого ряда ферментов. По-видимому, БСА блокирует на сорбенте места неспецифической сорбции ферментов [Ramadoss et al., 19831. [c.368]

Однако значительно большие возможности открывает нековалентное связывание НК с матрицей целлюлозы. Во-первых, его удается осуществить и для относительно малых фрагментов НК, а во-вторых, с целлюлозой можно связать и нативную двунитевую ДНК. Способы такого связыпания исиользуют неспецифическую сорбцию, вернее, запутывание нитей НК в сетке целлюлозы. Здесь ото происходит успешнее, чем в агарозе, у которой пустоты крупнее, а инти собраны в плотные жгуты. Во многих сл учаях связь оказывается достаточно прочной, чтобы обеспечить надежное задержание НК в колонке аффинного сорбента в условиях многократных промывок, связывания и элюции очищаемых макромолекул. [c.392]

Очевидно, что такой сорбент частично сохраняет анионные свойства за счет остаточных свободных аминогрупп АЕ-целлюлозы, поэтому аффинную хроматографию следует вести в присутствии достаточной концентрации соли, блокирующей неспецифическую ионную сорбцию по этим группам [Feist, Danna, 1981]. Использование этого сорбента для разделения меркурированной и немеркурированной РНК рассмотрено ниже как пример применения аффинной хроматографии. [c.397]

Этот выбор диктуется в основном стремлением сохранить нативность очищаемого белка и максимально уменьшить неспецифическую сорбцию других компонентов исходной смеси. Само аффинное связывание вещества с лигандом, как правило, от состава буфера я ид-кой фазы зависит мало. Интересами сохранения нативности и растворимости белка диктуются выбор pH, наличие соли, а иногда (например, для белков мебран) введение в буфер добавок органических растворителей или детергентов. Все это определяется известными свойствами данного белка. Неспецифическая сорбция примесей, в частности балластных белков, на матрице и спейсерах происходит за счет тех же самых сил (притяжения разноименно заряженных групп, водородных связей и гидрофобных взаимодействий), которые обусловливают и биоспецифическое снизывание вещества с лигандом. Избирательность и прочность аффинной связи обусловлены кооперативным действием различных сил в области связывания, где они дополняют друг друга. Благодаря такой кооперации имеется возможность ввести в буфер факторы, ослабляющие действие сил какого-либо типа или даже всех их одновременно, но в такой степени, что биоспецифическое аффинное взаимодействие будет ослаблено лишь частично, в то время как неспецифическую сорбцию удастся подавить практически полностью. [c.404]

Приемы, используемые в аффинной хроматографии, в основном те же, что и в других рассмотренных выше методах, поэтому достаточно будет остановиться лишь на некоторых отличительных особенностях. Уже упомина.лось, что в большинстве случаев решается задача аффинной очистки одного вещества, сила связывания которого на сорбенте намного превосходит силы неспецифической сорбции других компонентов исходной смеси. Это позволяет эффективно использовать аффинную хроматографию и на ранних стадиях очистки вещества. Нередко на этой стадии в препарате могут содержаться выпавшие в осадок белки или липопротеиды, способные забивать колонку. В таком случае следует элюцию вести в свободном объеме, промывая сорбент на фильтре (с периодическим перемешиванием). Заметим, что промывку сорбента в объеме выгоднее вести несколько раз небольшими пори иями элюента, чем сразу большим его объемом. Аффинная хроматография в свободном объеме удобнее, чем колоночная, и в том случае, когда нужный белок очень мало представлен в неочищенном экстракте, но хорошо связывается сорбентом. Хроматография в объеме позволяет использовать такую концентрацию суммарного белка в экстракте, с которой из-за вязкости было бы трудно работать на колонке. Аффинная сорбция в объеме широко ис1ю.1гьзуется в радио-иммунных методах исследования. [c.409]

Поскольку, как указано выше, аффинная сорбция на триази-нолых красителях обусловлена не каким-либо специальным сродством, а лишь стерическим соответствием конфигурации молекулы красителя строению и пространственной ориентации активного центра фермента, в каждом случае имеет смысл поискать такой краситель, у которого это соответствие окажется наилучшим. [c.421]

Пример 3. Очистка ДНК-полимеразы а из зародыша цыпленка [Yamagu hi et al., 1982]. Аффинной хроматографии здесь также предшествовали четыре стадии ионообменной хроматографии и гель-фильтрация. Сорбция фермента на голубой агарозе в этом [c.421]

Пористое стекло (диаметр пор 5 — 250 нм), как и наиболее широко применяемые носители иа основе агарозы, отличается низкой неспецифической сорбцией и высокой емкостью. Аффинная хроматография нашла широкое применение при разделении ферментов, полнпептидных и белковых гормонов, антител, антигенов, а также транспортных и рецепторных белков. [c.354]

Константы, входящие в уравнения изотерм сорбции, могут быть найдены только экспериментально. Пока их значения надежно определены лишь для некоторых видов сорбентов и загрязнителей. Приводимые в литературе графики изотерм сорбции также могут дать объективную информацию лишь об исследованньгх веществах. Адсорбционные характеристики большинства из сотен тысяч химических соединений, выбрасываемьк в атмосферу, изучены слабо. Поэтому приходится считать процессы адсорбции любьк веществ на одинаковых сорбентах подобными. На этом основании изотерму сорбции рассматриваемого загрязнителя рассчитывают по эмпирическому уравнению или графику для какого-либо из хорошо исследованных соединений, считая его стандартным, с введением поправки, которую называют коэффициентом аффинности и находят из соотношения [c.392]

Элюирование из колонки в аффинной хроматографии может вызываться каким-либо растворимым аффиантом, образующим более прочное соединение с выделяемым веществом, чем привитые аффинные лиганды, изменением ионной силы раствора или температуры. В наиболее общем случае элюирование достигается путем изменения pH раствора, приводящего к подавлению диссоциации функциональных групп, ответственных за образование химической связи между сорбатом и сорбентом. Учитывая селективность сорбции, разделение в аффинной хроматографии часто реализуется по простейшей схеме динамической сорбции 1юглощение целевого биологически активного вещества на колонке с удалением в фильтрат несорбируе-мых примесей и его последующее элюирование в виде единственного хроматографического пика. Подобная схема оказывается наиболее удобной при решении препаративных задач. [c.201]

Одним из последних вариантов лигандообменной хроматографии явилась аффинная хроматография на хе-латах металлов , представляющая собой гибрид лигандообменной и аффинной хроматографии. В металло-хелат-аффинной хроматографии активные ценгры насадок, на которых происходит сорбция, обычно представляют собой систему ион переходного металла - иминодиацетатная группа, связанная с матрицей сорбента достаточно длинной группировкой. Связывание белка с системой металл -иминодиацетат - матрица происходит благодаря образованию координационных связей. Обычно процесс проводят в интервале значений pH от 6 (ацетатный буфер) до 8 (фосфатный буфер). Металло-хелат-аффинная хроматография представляет в первую очередь интерес как препаративный метод биохимии. [c.211]

Несмотря на значительное число статей [6, 8, 10, 12—14], в которых эмпирически трактуется большинство варьирующих факторов, влияющих на результаты аффинной хроматографии, теоретические рекохмендации, основанные на физико-химических свойствах и закономерностях, очень редки. Наиболее конструктивна разработка Грейвсом и Ву [3] простых кинетических и равновесных моделей аффинной сорбции и десорбции. Анализировалась в отдельности адсорбционная и десорбционная фазы аффинной хроматографии, но в каждой фазе рассматривались в первую очередь ограничения, основанные на равновесных закономерностях, и не принимались во внимание кинетические процессы (диффузия и реакция). [c.20]

Для успешного выделения фермента с помощью аффинной хроматографии необходимы очень низкие значения К[ или Кь- Обе константы должны быть много меньше, чем любая константа диссоциации для неспецифической сорбции белка на поверхности матрицы. Максимум для Кь может быть оценен следующим образом. Исходя из концентрации ингибитора в нерастворимом аф-финанте, равной 10" моль/л, и требования 99%-ного связывания фермента при хроматографии неочищенного материала, содержащего 10 моль/л фермента в объеме, равном тройному объему нерастворимого аффинанта, в качестве верхнего предела для Кх получают значение 10 моль/л. В 3%-ном растворе белка, содержащем активный фермент с молекулярной массой 10 в количестве [c.62]

Отсюда следует, что, поскольку между ингибитором и ферментом образуется связь, в целом процесс очистки следует рассматривать скорее как осаждение, а не как хроматографию. Это может быть продемонстрировано изотермой адсорбции для аффинной хроматографии, приведенной на рис. 5.1 суммарная изотерма адсорбции (5) может быть определена как сумма изотерм специфической (1) и неспецифической (2) адсорбции. Специфическая изотерма адсорбции характеризует идеальную специфическую сорбцию с постоянной и относительно высокой адсорбционной энергией АО для всех адсорбируемых частиц. Сорбция прекращается, когда все доступные аффинантные центры заняты. [c.63]

Однако из упоминаемых выше экспериментов все же не следует, что только расстояние аффинанта от матрицы — решающий фактор, определяющий силу связывания. Изучая гидрофобные пространственные группы О Карра и др. [25—27] показали, что во многих случаях сорбция более зависит от гидрофобного связывания выделяемого вещества гидрофобной цепью, чем от образования биоспецифического комплекса. В качестве одного из наиболее часто цитируемого в статьях о влиянии пространственных групп примера, относящегося к аффинной хроматографии р-галак-тозидазы на носителях [31], можно рассмотреть следующие сорбенты [c.71]

Ограниченная диффузия возникает, если молекулярная диффузия в порах матрицы затруднена из-за экранирования подхода макромолекул к прикрепленному аффинному лиганду. Экспериментально вклад этой диффузии можно определить с большим трудом, но для аффинной хроматографии на очень пористых носителях эти трудности становятся минимальными. На практике для достижения равновесных условий желательно, чтобы скорость потока была по возможности низкой. Например, при скорости потока 400 мл/ч для выделения стафилококковой нуклеазы на колонке объемом 20 мл небольшие количества нуклеазы появлялись в первом пике вместе с белковыми примесями, особенно если общая концентрация белков в образце была высока (20—30 мг/мл) [5]. Однако даже при такой высокой скорости потока нуклеаза полностью сорбировалась, если наносился менее концентрированный образец. Зависимость связывания лактатдегидрогеназы на №-(6-аминогексил)-5 -АМР — сефарозе от скорости потока пссле-дована Лоу и др. [21]. Было найдено, что увеличение скорости потока относительно мало влияет на сорбцию. При высоких скоростях потока эффективность колонки (ВЭТТ), а также связываемость р уменьшаются. Влияние скорости потока более заметно в небольших колонках, с которых часть белка с ферментативной активностью элюируется со свободным объемом. Влияния концентрации инертного белка (бычьего сывороточного альбумина) при высоких скоростях потока (67 мл/ч) также не обнаружено. [c.84]

В одноразовом методе сорбции на аффинном сорбенте играет важную роль концентрация фермента в исходном растворе. В табл. 3.1 приведен процент насыщения иммобилизованного аффинанта сорбируемым ферментом при различных концентрациях фермента в исходном растворе [7]. Очевидна прямая пропорциональность. Такая же зависимость обнаруживается и на рис. 5.3, где приведены теоретические и экспериментальные данные для содержания комплекса фермент — иммобилизованный лиганд на аффинных сорбентах с различной концентрацией лиганда. Для [c.84]

Если аффинный сорбент приготовлен из заряженного аффиианта, то при увеличении ионной силы раствора аффинность сорбента по комплементарной ему макромолекуле уменьшается. Сорбцию следует проводить из растворов с низкой ионной силой однако этот процесс может вызвать нежелательные следствия ко- [c.91]

Смотреть страницы где упоминается термин Сорбция аффинная: [c.10] [c.11] [c.364] [c.374] [c.405] [c.405] [c.408] [c.414] [c.425] [c.434] [c.442] [c.443] [c.444] [c.174] [c.131] [c.24] [c.6] [c.10] [c.64] [c.68] [c.85] [c.86] [c.90]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология