Бактериальная в ферментативном анализе

Гидролизующий полинуклеотиды бактериальный фермент, который широко используется для анализа ближайших соседей (гл. 2, разд. 3,4), может осуществлять гидролиз ДНК и РНК до З -нуклеотидов. Установлена трехмерная структура молекулы нуклеазы стафилококков, состоящей из 149 аминокислотных остатков [69—71]. Так же как и в случае панкреатической рибонуклеазы, молекулу нуклеазы стафилококков можно расщепить на два активных пептида (фрагменты, построенные из остатков 6—48 и 49—149), которые, соединяясь, образуют комплекс, обладающий ферментативной активностью [71, 72]. Комплекс образуется даже в том случае, когда от меньшего пептида отщеплены остатки 43—48. Однако остаток 01и-43, который связывает имеющий существенное значение ион Са +, необходим для проявления ферментативной активности [72], так же как и пептидная связь с соседним треонином (Тге-44). [c.124]

Способы получения требуемых последовательностей нуклеотидов из клонотек генов можно разделить на три группы. При использовании первой группы методов рекомбинантные бактерии или фаговые частицы исследуют на присутствие в них искомых последовательностей нуклеотидов путем последовательного перебора случайных клонов. При таком подходе, получившем название скрининга, творческие усилия исследователя направлены только на облегчение самого процесса анализа клонов, например, на его автоматизацию. Во втором случае, присутствие нужных последовательностей обнаруживают косвенно, по появлению в бактериальных клетках или фаговых лизатах бляшек продуктов экспрессии искомых генов - РНК, белков или ферментативной активности, т.е. определенного фенотипа, который отличает такие клоны от соседних, не содержащих соответствующих последовательностей. В этом случае исследователь среди большого количества суммарных клонов осуществляет выбор тех, которые резко отличаются от соседних по своему фенотипу, например, цвету колоний. При таком подходе производится выбор требуемого фенотипа среди большого числа других фенотипов. Реализация третьего подхода требует создания селективных условий, при которых преимущество в размножении получают те клоны, которые отвечают требованиям отбора, например, приобрели способность к росту на селективных питательных средах в присутствии антибиотика или в отсутствие аминокислоты в случае исходно ауксотрофного штамма. Последний подход, кроме своего необыкновенного изящества в замысле, демонстрирует самую высокую эффективность, так как позволяет в одно касание освободиться от всех нежелательных примесей в виде ненужных клонов. [c.162]

Реакции, при которых происходит появление или исчезновение спектрофотометрически определяемых соединений, составляют последнюю группу методов, применяемых при анализе стероидов. Примером таких реакций может служить ферментативный анализ стероидов, основанный на использовании окси-стероиддегидрогеназ бактериального происхождения, нуждающихся в качестве кофермента в НАД (никотинамидадениндину-клеотид) [c.70]

Попытка обобщить данный материал сделана в настоящей книге, которая представляет собой логическое продолжение первой части, опубликованной ранее отдельным томом и посвященной анализу специфичности и кинетических аспектов действия ферментов на относительно простые субстраты, такие как алифатические и ароматические спирты и альдегиды, производные карбоновых кислот, замещенные аминокислоты и их производные (не выше ди- или три-пептидов). Главное внимание в первой части книги уделялось характеру фермент-субстрат ных взаимодействий на достаточно ограниченных участках активного центра и кинетическим проявлениям этих взаимодействий. В основе первой части книги лежит экспериментальный материал, полученный при изучении специфичности, кинетики и механизмов действия цинк- и кобальткарбоксипеп-тидазы, химотрипсина и трипсина из поджелудочной железы быка, алкогольде-гидрогепаз нз печени человека и лошади и пенициллинамидазы бактериального происхождения. Итогом первой части книги явились обобщение и формулировка кинетико-термодинамических принципов субстратной специфичности ферментативного катализа. [c.4]

Л. а. используют в иммунохим. анализе для определения антител, гормонов, лек. препаратов, вирусных и бактериальных антигенов по концентрации комплекса антиген-антитело. При этом в иммунном флуоресцентном анализе к антителу непосредственно присоединяют флуоресцирующие в-ва, напр. РЗЭ, флуоресцирующие красители (чувствительность метода 10" моль/л), а в иммуноферментном анализе к антителу присоединяют фермент и в результате ферментативной р-ции, сопровождаемой биолюминесценцией, определяют ферментативную активность (чувствительность метода 10" моль/л). [c.614]

Определение соотношения оснований в полученной РНК путем анализа ближайшего соседа (меченные Р субстраты) при использовании ДНК-затравки с резко отличающимся нуклеотидным составом показало, что образующаяся РНК комплементарна затравочной ДНК- При использовании олиготимидиловой кислоты в качестве затравки из смеси рибонуклеозид-5 -трифосфатов в реакции участвует лишь аденозин-5 -трифосфат с образованием полиадениловой кислоты. Аналогичным образом при использовании ферментативно синтезированного сополимера тимидиловой и дезоксиадениловой кислот (с прямо противоположной последовательностью оснований) в качестве затравки для РНК-полимеразы из Е. oli был получен продукт, содержащий лишь адениловую и уридиловую кислоты (даже в присутствии других нуклеотидов). Щелочной гидролиз (сопровождающийся переносом Р ) показал, что адениловые и урациловые остатки противостоят друг другу, а отсюда затравка определяет как состав, так и последовательность оснований в продукте. (Для частично очищенной бактериальной РНК-полимеразы затравкой могут служить полирибонуклеотиды возможно, при этом функционирует не ДНК-зависимая полимераза, а какой-то другой фермент.) [c.319]

Еще одним доказательством комплементарной природы РНК, полученной на данной ДНК-затравке, служит образование специфического комплекса при нагревании с последующим охлаждением смеси ДНК-затравки и РНК-продукта. При эквимолекулярных соотношениях два полинуклеотида образуют гибридные комплексы, причем ренатурация ДНК исключается благодаря большей стабильности гибрида. Образование гибрида специфично для ДНК-затравки и не происходит с другими дезоксинуклеиновыми кислотами, даже если они обладают сходным нуклеотидным составом. Следовательно, средний нуклеотидный состав, анализ ближайшего соседа и полная комплементарность последовательности — все говорит о доминирующей роли последовательности нуклеотидов в затравочной ДНК в определении природы ферментативно синтезированной РНК- При использовании определенной бактериальной системы Mi ro o us lysodeikti us) не было обнаружено, чтобы матрица и продукт образовывали промежуточные соединения, гибриды (в отличие от ДНК-полимеразы). Далее, после ферментативного синтеза РНК не происходит изменений в плотности матрицы и денатурации (разделении нитей) ДНК- Следовательно, либо двухспиральная ДНК действует как матрица, не раскручиваясь, либо механизм заключается в том, что функционируют небольшие одноцепочечные олигонуклеотидные участки, непосредственно прилега- [c.319]

Вещества, служащие субстратами метаболизма, претерпевают в организме ряд ферментативных биохимических превращений. Последовательность биохимических реакций, направленных на модификацию того или иного субстрата до конечного продукта in vivo, называют метаболическим путем или — в случае замкнутых процессов — циклом. Промежуточные продукты метаболического пути или цикла называют метаболитами. Даже в таком простом организме, как бактериальная клетка Е. oli, насчитывается несколько тысяч типов различных взаимосвязанных химических реакций. Упорядочение этих реакций может на первый взгляд показаться недостижимым. Однако при более глубоком анализе оказывается, что, несмотря на большое количество отдельных реакций, формирующих метаболизм организма в целом, число типов таких реакций относительно мало. Например, in ww двойная связь в основном образуется в результате реакции дегидратации. [c.311]

В разд. 18.1 рассматриваются различные типы клеточных препаратов, обычно используемых в энзимологических исследованиях, после чего следует описание того, как измеряется активность ферментов вообще и ферментов шести основных классов в частности (разд. 18.2). С помощью ферментов можно изучать различные процессы регуляции, связанные с изменениями их активности в разд. 18.3 рассматриваются эти процессы в целом, а также два основных типа регуляции — аллосте-рический и путем ковалентной модификации. Присутствие и отсутствие тех или иных ферментов у определенной бактерии зависит, разумеется, от ее генотипа. Но даже если у бактерии имеются определенные гены, их транскрипция и трансляция с образованием соответствующих молекул фермента могут и не происходить. Здесь следует учитывать факторы, участвующие в регуляции генетической экспрессии и, следовательно, синтеза ферментов, рассмотренные в разд. 18.4. И наконец, поскольку ферментативные реакции редко протекают в бактериальных клетках как изолированные процессы и чаще всего являются частью сложной сети метаболических путей и циклов с взаимозависимыми этапами, мы сочли нужным рассмотреть здесь некоторые общие и специальные методы анализа путей метаболизма (разд. 18.5). [c.375]

Несколько лет назад был разработан удобный и весьма чув-ствительпый метод радиометрического анализа, позволяющий определять активность NPT в бактериальных экстрактах. При этом используют АТР, в котором фосфор концевой (у) фосфатной группы замещен на радиоактивный изотоп Р. При ферментативной реакции NPT-II переносит радиоактивный фосфат с -32р д рр jjg антибиотик, который вследствие этого становится радиоактивным. Чтобы количественно определить продукты этой реакции, радиоактивный фосфорилированный антибиотик следует каким-либо образом отделить от высокорадиоактивного АТР. Для этого используют специальную ионообменную бумагу (фосфоцеллюлозу Whatman Р81), которая при pH проведения реакции связывает только антибиотик. Реакционную смесь наносят на поверхность небольщого куска бумаги и свободный АТР затем просто смывают с бумаги горячим фосфатным бу-феро.м, после чего бумагу высущивают и количество связывающейся метки определяют в сцинтилляционном счетчике. [c.346]

Фактически во всех ранних биофизических исследованиях ДНК имели дело с относительно короткими линейными молекулами. Авторадиографический анализ показал, что некоторые бактериальные ДНК замкнуты в кольцо, но препараты таких молекул удалось получить только после того, как были разработаны очень мягкие процедуры выделения, позволяющие избежать разрыва молекул за счет механической или ферментативной деградации. Впервые кольцевая ДНК в растворе была обнаружена при работе с бактериофагом 0X174. Нуклеотидный состав этой ДНК был необычен тем, что Хд Хт> а Хс Хс-Кроме того, она оказалась устойчивой к расщеплению экзонуклеазами. Из этой устойчивости следовало, что ДНК фага фХ174 представляет собой одноцепочечную кольцевую молекулу, и действительно, при электронно-микроскопическом исследовании препаратов этой ДНК, обработанной формальдегидом (чтобы устранить всякую внутримолекулярную вторичную структуру), увидели кольцевые молекулы. [c.383]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология