Ферментный определение антигенов и антител

Существуют три основных методических подхода для решения этой задачи. Первый способ — избирательное окрашивание нейронов, выделяющих определенный нейромедиатор, может осуществляться с помощью преобразования естественного медиатора в его флуоресцирующее производное. В этом случае флуоресценция определенных групп клеток поможет выявить специфические связи в структурах мозга. Второй экспериментальный подход связан с введением молекул медиатора, предварительно меченного радиоактивным изотопом. Нейронные окончания, содержащие исследуемый медиатор, способны избирательно захватывать метку. Затем их легко выявить методом авторадиографии. Третий способ обнаружения специфических связей в нервной системе состоит в использовании высоко специфичной способности узнавать либо антигенные детерминанты медиатора, либо определенные ферментные белки, участвующие в метаболизме нейромедиаторов, либо нейрорецептор-ные компоненты на мембране клетки. Последние считаются наиболее убедительным свидетельством в пользу существования конкретных нейрохимических взаимодействий межцу клетками и зонами мозга. Обычно для иммунохимической идентификации используют флуоресцентный краситель или изотоп, который маркирует антитела. В последние годы широко распространились методы, использующие антитела, меченные частицами тяжелых металлов, например коллоидного золота, железа и др. [c.224]

Антигены и антитела. До сих пор не описано каких-либо серийных биосенсорных систем для определения антигенов и антител. В разработанных недавно ферментных иммуносенсорах измеряют активность ферментов-маркеров, связанных с определенным количеством антигена. Содержащий маркер антиген и немеченый определяемый антиген конкурируют между собой за связывание с определенными сайтами антител на мембране, покрывающей электрод. Неизвестная концентрация немеченого антигена обратно пропорциональна измеряемой электродом активности фермента-маркера. Однако в настоящее время чувствительность этого метода низка по [c.274]

Большинство методов ИФА основано на фотометрическом, флуориметрическом, люминесцентном или электрохимическом определении продукта ферментативной реакции. Обычно в равновесных анализах стадия регистрации ферментативной активности занимает относительно длительный промежуток времени (от 30 мин и более). При сокращении длительности ИФА за счет проведения реакции антиген — антитело в кинетическом режиме необходимо применять быстрые методы детекции ферментной метки, иначе время осуществления ферментативной реакции будет лимитировать время анализа в целом. [c.110]

Метка при этом должна содержаться в том компоненте, который образует комплекс с анализируемым веществом. Например, для анализа определенного антигена нужно располагать антителом, специфичным к этому антигену, ввести в него метку (радиоактивную, ферментную, люминесцентную и т.д.) и количественно перевести анализируемое вещество в комплекс. Для того чтобы достичь максимального уровня этого перехода, меченое антитело нужно брать в избытке. Но тогда нужно предусмотреть процедуру отдейения комплекса от избытка меченого антатела. Для этих целей используют иммобилизацию анализируемого компонента на твердой поверхности. В этом случае комплекс антиген — антитело остается на поверхности, тогда как избыток меченого антитела, не вошедший в состав комплекса, легко удаляется. [c.258]

В большинстве ранних публикаций по потенциометрическим ферментным детекторам описаны связанные с мембраной антигены и их применение для определения специфических антител [6, 7 ]. Присоединением ионофора к антигену можно достичь усиления выходного сигнала [8 ]. В более поздних публикациях описаны [c.206]

При добавлении фермента образуется комплекс (Fab ) 2-фермент, который может применяться для определения антигена в рассмотренных выше методах ИФА с использованием меченых специфических антител (например, в сэндвич -методе). При необходимости ферментная метка может вводиться после взаимодействия гибридного антитела с определяемым антигеном. Хотя этот подход был предложен около 20 лет назад и привлекает своей элегантностью , он не нашел практического применения из-за трудоемкости получения реагентов. [c.105]

Непрямой ИФА чаще всего применяют для количественного определения в сыворотке специфических антител, вырабатываемых против патогенов. В этом методе (рис. 2-13) лиганд или антиген, иммобилизованный на твердом носителе, инкубируют с анализируемым образцом, затем твердую фазу промывают и инкубируют с антивидовыми антителами к иммуноглобулинам, содержащими ферментную метку (Атг—Ф). После отделения твердой фазы измеряют активность связанного с ней фермента, которая прямо пропорциональна концентрации антител (Ат) в исследуемом образце. [c.27]

Следует отметить, что с иммобилизованным антигеном могут связываться не только свободные меченые антитела, но и антитела, провзаимодействовавшие с определенным антигеном только одним активным центром. Вероятность такого взаимодействия возрастает с уменьшением размеров антигена, что следует учитывать при определении конкретных соединений. Разделение компонентов на иммуносорбенте целесообразно проводить в кинетическом режиме, поэтому эта стадия не лимитирует время анализа в целом. Недостаткам метода является контакт ферментной метки с анализируемым образцом, что может вызвать изменение ферментативной активности. [c.93]

Применение в ИФА антигенов и антител, иммобилизованных на нерастворимых носителях, дает возможность эффективно разделять компоненты аналитической системы перед стадией определения концентрации ферментной метки. Такой подход универсален и может применяться для широкого круга соединений — от гаптенов до микробных клеток. Однако нерастворимые иммуносорбенты имеют и некоторые отрицательные стороны, а именно 1) возможность неспецифического связывания компонентов с носителем 2) значительное время анализа (до нескольких часов) из-за длительности реакции антиген — антитело, определяемое низкой концентрацией иммобилизованного агента- (например, при использовании непористых сорбентов — полистирольных плат или пробирок) или диффузионными затруднениями при использовании пористых сорбентов (сефароза, пористое стекло, силохром и т. д.) 3) методические сложности, связаниью с трудностями точного дозирования и промывок иммуносорбентов па основе пористых носителей 4) существенное влияние неоднородности сорбциоииых свойств полимерных носителей (микроплаты и пробирки из полистирола, поливинилхлорида, полиметилметакрилата и т. д.) на точность и воспроизводимость результатов анализа. [c.111]

Определение константы связывания. Используют метод радиоиммунного анализа (РИА). Постановка метода сходна с постановкой ИФА (с. 320), с тем исключением, что вместо конъюгатов антител с ферментной меткой для выявления связывания антител с антигеном используют антимышиные антитела с радиоактивной меткой. В каждую лунку вносят по 50—100 мкл антимышиных антител (10—30 нг около 20 000 срт). Инкубируют при комнатной температуре около 2 ч. Затем микропланшеты тщательно отмывают (с. 321), разрезают и индивидуальные лунки просчитывают в Y-счетчике. [c.324]

Выделение чистых И. проводится с помощью ионообменных смол с послед, гель-фильтрацией. Для мн. целей используют препараты миеломных И., особенно минорных классов. Антитела выделяют с помощью иммуносорбентов - фиксированных на нерастворимых носителях (напр, целлюлозе) антигенов. Обнаружение и количеств, определение И. разных классов проводят иммунологич. методами с помощью соответствующих антисывороток. Для определения кол-ва антител используют методы преципитации (иммунная р-ция осаждения антигена антителом), агглютинации (взаимод. антитела с двумя клетками), нейтрализации бактерий и вирусов и др. Широкое распространение получают радиоиммунные и ферментно-иммунные методы, обладающие исключительно высокой чувствительностью и позволяющие определять очень малые кол-ва антител (или антигенов) в смесях с др. в-вами. [c.217]

Меченные ферментом антитела стали получать с середины шестидеоггых годов. Сначала их использовали для визуального обнаружения антигенов в гистологии и линий преципитации в иммуноэлектрофорезе [1 ]. Количествганое определение иммунореагентов с помощью ферментной метки стало возможным после разработки способов иммобилизации антигенов на твердой подложке [2]. Этим работам предшествовало внедрение в иммуноанализ в [c.205]

Третий вариант представляет собой иммунометрический метод, или сэндвич-ша.лт, для которого используют антитела, содержащие ферментную метку. По способу проведения этот вариант анализа напоминает последовательный анализ. Сэндвич-анализ удобен для определения крупных антигенов, таких, как ферритин, тиреотропин или вирус гепатита. Поскольку отношение площади поверхности к объему для стекловолокнистой фильтровальной бумаги весьма велико, на фильтре может быть адсорбировано довольно большое количество антител. Благодаря этому анализ на фильтре может проходить с достаточно высокой скоростью. [c.300]

Активные центры (центры связывания) антител расположены в вариабельных областях пептидных цепей. Антитела класса IgG двухвалентны, т. е. имеют два центра связывания антигена. Таким образом, каждая молекула антитела может присоединить две молеьсулы антигена. С другой стороны, к каждой молекуле антигена может присоединиться несколько молекул антител, поскольку на антигене есть несколько антигенных детерминант и к каждой из них образуются антитела. В результате возникают сложные молекулярные комплексы (см. рис. 20.1, г). Такие комплексы могут выпадать в осадок на этом основана реакция преципитации для обнаружения антител или антигенов. Если антиген не свободен, а содержится в мембране клеток, то происходит склеивание (агглютинация) клеток антителами. Реакция агглютинации также используется для обнаружения антител и антигенов (в частности, при определении групп крови). В результате действия антител может разрушаться клеточная оболочка — происходит лизис клеток. В лизисе клеток, помимо антител, участвует комплемент — сложная ферментная система, находящаяся в плазме крови. [c.477]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология