Количественные методы иммунодиффузии

КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ МЕТОДЫ ИММУНОДИФФУЗИИ [c.157]

Сравнительно новой разновидностью зонального электрофореза является электрофорез на ацетат-целлюлозной мембране [6]. Ацетат-целлюлозная мембрана, по-видимому,— очень хорошая поддерживающая среда, уже нашедшая благодаря ряду достоинств широкое применение. Выше мы отмечали, что приготовление крахмального и агарового гелей—довольно трудоемкая операция, осложняющая метод. В то же время способы предварительной обработки ацетат-целлюлозной мембраны почти так же просты, как и в случае с фильтровальной бумагой. При этом разделение белков происходит лучше и быстрее, а для анализа достаточно 5—1000 мкг белка, растворенного в объеме 0,1—10 мкл. Как белки, так и гликопротеиды очень хорошо окрашиваются на ацетат-целлюлозной мембране, поэтому она является прекрасной поддерживающей средой с точки зрения количественной оценки этих соединений. Электрофорез на ацетат-целлюлозной мембране позволяет получить больше белковых фракций сыворотки крови, чем электрофорез на бумаге, но меньше, чем электрофорез в крахмальном геле. С помощью электрофореза на ацетат-целлюлозной мембране можно определять весьма малые количества индивидуальных белков, благодаря чему он очень подходит для анализа гомогенности выделенного нативного белка. Ацетат-целлюлозные мембраны могут быть использованы также в опытах по иммунодиффузии, что является еще одним достоинством этого метода электрофореза. [c.14]

Двумя наиболее важными иммунологическими методиками, полезными для характеристики биохимических препаратов, являются иммунодиффузия и количественная преципитация. Оба метода требуют наличия соответствующих антисывороток первый метод более прост. Его практическая сторона [c.52]

Простая радиальная иммунодиффузия дает возможность количественно определять антигены (Аг). В агаровый гель добавляют антитела (Ат), затем наливают его на предметные стекла и оставляют для застывания. В застывшем геле вырезают лунки и вносят в них стандартный объем различных по концентрации растворов антигена. Стекла оставляют не менее чем на 24 ч. В течение этого времени антиген диффундирует в гель и образует с антителами растворимые комплексы (при избытке антигена). Комплексы продолжают диффундировать, связывая все больше антител, пока не будет достигнута точка эквивалентности и не произойдет осаждение комплексов с образованием кольца. По радиусу зоны, ограниченной кольцом преципитации, определяют ее площадь. Величина площади пропорциональна концентрации антигена, которую вычисляют с помощью калибровочной кривой (график внизу). Для определения концентрации антител применяют тот же метод, но в обратной постановке, т. е. в гель добавляют антиген, а антитела вносят в лунки. [c.529]

Попытки разработать методы иммунодиффузии, позволяющие количественно оценивать содержание антигенов и антител, делались неоднократно. Одна группа таких методов основьгоается на двойной диффузии в геле по Ухтерлони (см. стр. 131), другая — на измерении скорости диффузии и степени мутности полос преципитации при иммуноэлектрофорезе (стр. 137). Пока эти методы еще не получили широкого распространения. [c.157]

Иммунологическая количественная оценка компонентов после гель-фильтрации возможна главным образом при осуществлении несколько модифицированного метода Манчини [58]. В этом случае после гель-фильтрации проводят иммунодиффузию в геле агарозы, содержащем антитела. Существенным моментом в этой методике является создание надежного контакта геля агарозы с гелем сефадекса при сохранении полученной картины разделения. Это удается осуществить, осторожно помещая 1,5%-ный гель агарозы размером 10-10 см на слой сефадекса. По-видимому, этот метод найдет применение при количественном анализе белков, способных к образованию полимеров. На рис. 8 приведен пример количественного анализа высокомолекулярного секреторного JgA в присутствии мономера JgA [59]. [c.272]

Кроме метода титрования существуют и другие способы количественного определения антигенов путем иммуноэлектрофореза. Был описан метод, основанный на принципе простой иммунодиффузии f80, 81, 1962], при которой углубления для антигенов и антител примыкают непосредственно друг к другу. Антиген, находящийся в одной части геля, диффундирует в другую, содержащую антитела, и на границе этих двух частей образуется линия преципитации. Первичная зона преципитации растворяется затем в избытке антигена, продолжающего поступать благодаря диффузии в ту часть геля, где находятся антитела. Растворимые комплексы антиген-антитело вновь преципи-тируют при реакции с антителами в прилежащей зоне геля. Описанная последовательность событий — преципитация, растворение и повторная преципитация — создает впечатление, что преципитат движется. Путь, пройденный передним краем преципитата за тот или иной период времени, может служить мерой для определения концентрации антигенов. При этом в качестве стандартов необходимо использовать образцы с известной концентрацией антигена. При количественном иммуноэлектрофорезе для проведения простой иммунодиффузии разделенных компонентов в геле вырезают широкую канавку, непосредственно примыкающую к лунке с антигеном (рис. 85), и заполняют [c.240]

Строго говоря, площадь под пиком преципитата пропорциональна количеству внесенного антигена и обратно пропорциональна концентрации антител в геле. Если допустить, что высота пика преципитата пропорциональна его площади, то можно с достаточной точностью определить количество антигена путем измерения расстояния от верхнего края лунки до вершины пика. Для получения калибровочной кривой на гель наносят ряд стандартных антигенов с известной концентрацией. Сколари и др. [1156] обнаружили, что линейная зависимость между площадью пика и количеством антигена сохраняется в более широком интервале концентраций антигена по сравнению с такой же зависимостью между концентрацией антигена и высотой пика. Точность метода зависит от того, насколько близки между собой размеры молекул и величина зарядов исследуемых и стандартных антигенов. Воспроизводимость количественных определений наиболее высока в том случае, когда образуются симметричные пики преципитации с отчетливыми внутренними и внешними границами. Стандартная ошибка может при этом составлять 2—5%, несколько превышая ошибку, которую дает простая радиальная иммунодиффузия при оптимальных условиях [807]. [c.250]

Оказалось, что получаемая антисыворотка характеризуется реакцией лишь с экстрактами предстательной железы при иммунодиффузии и не взаимодействует с аналогичными препаратами других тканей. Более того, количественные исследования, проведенные после разработки чувствительного иммунофермент-ного метода анализа для антигена предстательной железы, показали, что линии клеток человека, полученные из карциномы предстательной железы (ЬНСаР и РС-3), экспрессируют этот антиген, а в линиях клеток, полученных из других тканей, этот антиген отсутствует. [c.153]

Методы, основанные на диффузии в геле, позволяют определять антигены и антитела лищь качественно, количественную же оценку реагирующих компонентов проводят разработанным позднее методом простой радиальной иммунодиффузии (рис. 29.4). [c.528]

Встречный электрофорез проводят в агаровом геле, pH которого устанавливают так, чтобы антитела (Ат) несли суммарный отрицательный заряд, а исследуемый антиген (Аг) - положительный. В электрическом поле антиген и антитела движутся навстречу друг другу и преципитируют. Принцип метода тот же самый, что и при двойной иммунодиффузии, однако чувствительность выше в 10 - 20 раз. Ракетный электрофорез позволяет количественно определять антиген в антителосодержащем геле, pH которого подбирают с таким расчетом, чтобы движения антител не происходило, а антиген нес суммарный отрицательный заряд. Линия преципитации очерчивает область в виде ракеты, длина которой пропорциональна концентрации антигена. Определить эту концентрацию можно по калибровочной кривой. Внизу справа - фотография окрашенного геля. Оба метода основаны на различии суммарных зарядов антигена и антител при выбранном pH для большинства антигенов такие различия существуют, так как антитела имеют более высокую изоэлектрическую точку (т. е. несут нейтральный заряд при более высоком значении pH, чем большинство антигенов). Если заряды антигена и антител существенно не различаются, можно химически модифицировать антиген, чтобы сдвинуть изоэлектрическую точку. Ракетный электрофорез проводят и в обратной постановке, если требуется определить концентрацию антител здесь важно подобрать правильно гель и pH для иммобилизации антигена, чтобы не нарушалась его структура и не возникло препятствий для реакции антиген-антитело. (Р - диаметр кольца преципитации.) [c.530]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология