Иммунодиффузия двойная

Рис. 30. Картины преципитации прн двойной радиальной иммунодиффузии для различных антигенов и их комбинаций в периферических лунках

Реакция преципитации в геле двойная иммунодиффузия [c.528]

ДВОЙНАЯ ИММУНОДИФФУЗИЯ В АГАРОВОМ ГЕЛЕ [211 [c.92]

Рис. 82, А. Двухмерная двойная иммунодиффузия из прямоугольных канавок. / — канавка для антигена — канавка для антител. Б. Иммуноэлектрофорез. Л 5—5 — электрофорегически разделенные компоненты смеси антигенов 2 прямоугольная канавка для смеси антигенов (стартовая зона электрофореза) б —канавка для антител (иммунной сыворотки).

В своей классической форме иммуноэлектрофорез представляет сочетание электрофореза в агаровом (или агарозном) геле с последующей двойной иммунодиффузией в той же среде. При двухмерной двойной иммунодиффузии антиген и антитело, помещенные в круглые или прямоугольные углубления в геле, мигрируют навстречу друг другу, в результате чего в нейтральной зоне среды, где они встречаются, образуются линии преципитации (рис. 82). Положение полос преципитации зависит от коэффициента диффузии антигена (скорость диффузии антитела можно рассматривать как постоянную) и концентрации антигена относительно антитела. Существует определенный интервал концентраций антигена и антитела, в котором их соотношение является оптимальным для образования преципитата. При двойной иммунодиффузии в этом интервале относительных концентраций (называемом зоной эквивалентности) получаются четкие линии преципитации. [c.236]

Для анализа антигенов, разделенных с помощью электрофореза или электрофокусирования в полиакриламидном геле, разработаны многочисленные методы иммунодиффузии. Так, для этой цели можно использовать различные варианты двойной иммунодиффузии. Цилиндрические столбики геля разрезают продольно на две половинки (см. разд. 1.15.6), а из пластин нарезают полоски, содержащие разделенные антигены. Разрезанный гель помещают на стеклянные пластинки, заливают их теплым раствором агара и дают ему застыть. Канавки для антител располагают на соответствующем расстоянии от полиакриламидного геля. Как только полиакриламидный гель покроется слоем агара толщиной 1 мм, в непосредственной близости от него сразу же вырезают канавку для антисыворотки. Если для анализа используют разрезанные вдоль столбики полиакриламидного геля, то их кладут на слой агарового геля и в нем рядом с полоской геля по обеим ее сторонам быстро вырезают канавки для антител. Преципитаты образуются под полоской полиакриламидного геля. Столбик полиакриламидного геля можно также разрезать в поперечном направлении на диски и проанализировать присутствующие в них антигены методом двойной радиальной диффузии 203, 394]. [c.244]

Через месяц после первой инъекции берут кровь и определяют в сыворотке содержание антител методом двойной иммунодиффузии в агаровом геле (см. гл. 6) либо непрямым методом по связыванию на пластиковых панелях для микротитрования, нагруженных мышин ым IgG. [c.169]

Агар — для двойной диффузии в геле (ДДГ) и радиальной иммунодиффузии. Некоторыми марками можно заменить более дорогую агарозу (см. приложение). [c.199]

Особое значение приобрела комбинация иммунодиффузии с электрофорезом, названная методом иммуноэлектрофорезаН]. С его помощью можно одновременно электрофоретически разделить компоненты белковой смеси и получить их иммунологическую характеристику. Простота осуществления, высокая разрешающая способность и, наконец, очень малое количество материала, требуемое для анализа, ставят иммуноэлектрофорез в ряд наиболее ценных методов аналитического изучения белков. Соединение иммуноэлектрофореза с двойной диффузией в геле позволяет выявлять идентичность определенных компонентов двух белковых смесей [10]. [c.19]

Анализ белков сыворотки осуществляется разнообразными им-мунохимическими методами, но здесь мы коснемся лишь двух методов двойной иммунодиффузии и иммуноэлектрофореза. Оба метода нашли широкое и многостороннее применение. Их используют для исследования нефракционированной сыворотки и для анализа отдельных белковых фракций. С появлением этих методов уда- [c.19]

Попытки разработать методы иммунодиффузии, позволяющие количественно оценивать содержание антигенов и антител, делались неоднократно. Одна группа таких методов основьгоается на двойной диффузии в геле по Ухтерлони (см. стр. 131), другая — на измерении скорости диффузии и степени мутности полос преципитации при иммуноэлектрофорезе (стр. 137). Пока эти методы еще не получили широкого распространения. [c.157]

В опытах по иммунодиффузии раствор исследуемого препарата отделен от антисыворотки зоной геля, в который и препарат, и антисыворотка могут диффундировать (двойная диффузия). По другому способу раствор антигена диффундирует в гель, в котором уже находятся антитела (одиночная диффузия). С течением времени концентрация реагентов становится достаточно высокой для специфической преципитации, и в том месте, где это произошло, линия или полоса преципитации становится видимой. В общем случае каждая система антиген — антитело образует отдельную полосу. Для решения специфических вопросов преципитации разработано большое число различных экспериментальных приспособлений двойную диффузию обычно проводят в чашках Петри или (в меньших масштабах) в тонкой пленке геля на предметном стекле. Полосы можно сделать более заметными путем окрашивания. Одиночную диффузию удобнее проводить в маленьких вертикальных трубочках. Недавно Охтерлони [68] опубликовал обзор с исчерпывающей библиографией, охватывающей все аспекты иммунодиффузионного анализа. Очищенный препарат следует проверить в опытах по одномерной или двумерной диффузии при возможно большем числе концентраций препарата [69]. Появление одиночной полосы с обеими антисыворотками является доказательством гомогенности препарата. Однако гомогенный препарат не обязательно должен давать одиночную полосу. Имеется несколько причин, которые могут вызвать образование двойной полосы и в случае гомогенного антигена. Это может объясняться недостаточным контролем температуры или осаждением, напоминающим кольца Лизеганга, при использовании определенных типов антител, если применяется очень сильная неразбавленная антисыворотка. Более того, установлено, что гомогенный антиген, имеющий несколько антигенных детерминантов, может дать несколько полос преципитации. Эти вопросы обсуждены Кроуле [70] и Фингером [71]. Тем не менее гетерогенность является наиболее обычной причиной двойных или множественных полос нрецииитации. Следует иметь в виду, что неантигенные компоненты нельзя определить этим методом, и нужно также отметить, что примеси, дающие перекрестную реакцию, не будут найдены, если их скорость диффузии меньше, чем у гомологичного антигена [72]. Это обычно не вызывает осложнений, за исключением случаев, когда компонент, дающий перекрестную реакцию, сам является довольно сильным антигеном и может порождать свое собственное антитело, [c.53]

Сочетание электрофореза с двойной иммунодиффузией впервые описали в 1953 г. Грабар и Уильямс [460]. С тех пор было опубликовано большое число подробных обзоров, посвященных иммуноэлектрофорезу [80, 237, 261, 459, 952]. Исходный метод [460] обычно называют макрометодом (рис. 82), так как в нем применяют относительно большую стеклянную пластинку (13Х Х18 см), покрытую слоем геля толщиной 2—4 мм. В геле вырезают поперечную канавку и заполняют ее образцом, смешанным с расплавленной при 45 °С агарозой. После завершения электрофореза в геле вырезают продольные канавки (параллельные направлению миграции) и заполняют их раствором преципитирующих антител, специфических по отношению к [c.236]

Широкое распросфанение получили реакции преципитации в полужидком геле агара или агарозы — двойная иммунодиффузия по Оухтерлони, радиальная иммунодиффузия, иммуно-элекфофорез и др. [c.178]

При обычном иммуноэлектрофорезе иммунодиффузию осуществляют так, как если бы это была двойная иммунодиффузия из расположенных под прямым углом канавок или из круглых лунок и канавок [80, 261, 952]. Однако разделенные при электрофорезе зоны не имеют четко очерченной формы, и вещества в них распределены неравномерно. Поэтому линии преципитации на иммуноэлектрофореграмме представляют собой более или менее удлиненные симметричные или асимметричные дуги. Удлинение дуг наблюдается, в частности, в тех случаях, когда в анализируемом образце содержатся вещества, обладающие одинаковой антигенной активностью, но разной электрофоретической подвижностью (наиболее известным примером подобных антигенов являются нормальные иммуноглобулины). Если антиген удерживается гелем (как, например, в случае микроглобулинов или ЛНП), то образуются линии преципитации неправильной формы. Иммуноэлектрофорез имеет более низкую чувствительность, чем двойная иммунодиффузия, поскольку в процессе электрофореза происходит разбавление антигенов вследствие расширения разделенных зон. [c.237]

Большинство преципитирующих антител относится к классу иммуноглобулинов О (1дО), обладающих лишь очень слабым отрицательным зарядом при pH 8—9. Поэтому электроосмоти-ческий поток смещает 1 0 к катоду. Электроэндосмос заметно уменьшается при замене агара агарозой. Путем подбора определенных соотношений агара и агарозы можно регулировать скорость эндосмоса, создавая тем самым оптимальные условия для электросинереза. Очевидно, что антитела следует помещать ближе к аноду, а антиген — ближе к катоду. Если расположить рядом несколько лунок с антигенами, то последние можно сравнивать между собой подобно тому, как это делается в методе двойной иммунодиффузии [186]. Видимые линии преципитации образуются в течение 1—2 ч. Избыток реагентов удаляют, продолжая электрофорез после образования преципитатов. При этом нет надобности отмывать гель перед окрашиванием, что позволяет в течение 3—4 ч получить полную картину окрашенных полос преципитации. [c.247]

Двойная иммунодиффузия. Используют 1,2%-ные (масс./об.) агаровые гели для двойной иммунодиффузии [26]. После образования дуг преципитации гели промывают буфером (0,15 М Na l в 10 мМ фосфатном буфере, pH 7,4) в течение 3 сут, а затем окрашивают, как описано для полиакриламидных гелей. [c.153]

Поликлональные антитела против GGT почек быка или GGT почек крысы (легкие формы) могут быть получены иммунизацией кроликов (самки, возраст 6—8 нед) путем инъекций в подушечки задних лап эмульсии, состоящей из 50 мкг фермента в 0,5 мл Na l-натрийфосфатного буфера с 0,5 мл полного стимулятора Фрейнда на животное. Через 2 нед вводят то же количество антигена (50 мкг GGT в 0,5 мл того же буфера), хорошо эмульгированного неполным стимулятором Фрейнда, подкожно в несколько мест шеи. Целесообразно повторить последнее введение еще через 2 нед. Через 10—15 сут берут пробы крови кролика инкубируют взятые пробы при 37 Х в течение 2 ч, затем оставляют на ночь при 4 °С и отделяют антисыворотку центрифугированием при 3000 g в течение 30 мин. В анализах методом двойной иммунодиффузии антисыворотка при разбавлении 1 128 (Na l-фосфатным буфером) все еще дает дуги преципи тации с разбавленной GGT (0,025 мг/мл). [c.153]

Достаточным критерием иммунологической чистоты белка можно считать образование только одной полосы преципитации при двойной радиальной иммунодиффузии (см. ниже), когда с испытуемым очищенным белком взаимодействует поливалентная антисыворотка, полученная в ответ на введение животному неочищенного белка. Здесь уместно напомнить, что даже идеальная очистка белка-антигена не гарантирует строгой однозначности иммунного ответа. У разных особей данного вида животного введение одного и того же, совершенно чистого антигена может вызвать различные иммунные ответы. В одном случае это может быть гиперпродукция практически гомогенной специфической популяции антител, в другом — ответ может оказаться поливалентным, так что в антисыворотке появится целый набор антител, способных связывать исходный антиген (но не только его). Этот набор иногда можно разделить электрофорезом или ИЭФ. О причинах поливалентного иммунного ответа было подробно сказано выше. Ввиду такой возможности иммунизацию, как уже упоминалось, следует проводить параллельно на нескольких животных, с тем чтобы иметь возможность выбора наиболее чистой моноспецифической антисыворотки. После этих необходимых замечаний можно рассмотреть заключительный этап очистки антител — использование иммуносорбентов. [c.109]

При анализе методом двойной иммунодиффузии препарат GGT, очищенный из почек быка с применением иммуноаффинной хроматографии, дает с гомологичными антителами три отдельные дуги преципитации, каждая из которых проявляет GGT-активность. Ферментный препарат может быть также разделен на четыре активные фракции изоэлектрическим фокусированием. GGT из почек крысы, очищенная на иммуноадсорбенте, дает с гомологичными антителами две дуги преципитации, обладающие ферментативной активностью. Эти наблюдения подтверждают предположение, что GGT присутствует в виде нескольких молекулярных форм, которые могут отличаться по содержанию сиаловой кислоты. Тэйт и Мейстер [34] впервые продемонстрировали, что чистая легкая форма GGT из почек крысы может быть разделена на несколько ферментных форм. Эти наблюдения делают очевидным тот факт, что молекулярные формы, очищенные на иммуноадсорбентах, иммунологически неразличимы. [c.162]

При изучении иммунных систем широко используется стандартный метод двойной иммунодиффузии, однако для получения тонких характеристик антител и антигенов может потребоваться анализ иммуноглобулинов в культуральных жидкостях или в сыворотках крови. В этих случаях сывороточные белки метят радиоактивным иодом, а иммуноглобулины, продуцируемые клетками в культуре, — биосинтетически или также иодом. [c.489]

Для проведения двойной иммунодиффузии агаровый гель наливают на предметные стекла, после застывания вырезают в нем лунки и заполняют их исследуемыми растворами антигена (Аг) и антител (Ат). Растворы диффундируют в гель, и на той линии, где происходит взаимодействие Аг и Ат (с перекрестным связыванием и осаждением иммунных комплексов), образуется линия (дуга) преципитации. Ее можно наблюдать визуально, если промыть гель (для удаления растворимых белков) и нанести на него краситель, выявляющий белки, например кумасси синий. Такой метод может быть использован для определения родства между антигенами (синие кружки) и в реакции с данными тест-антителами (желтый кружок). При этом возможны три основных типа результатов (цифры в синих кружках обозначают эпитопы антигена). В реакции (1) дуги преципитации, образованные антителами и двумя исследуемыми антигенами, сливаются это показывает, что антитела взаимодействуют с идентичными эпитопами на двух антигенах (эпитоп 1). Такой результат не означает полную идентичность самих антигенов, но только их идентичность в том смысле, что данные антитела не выявляют различий между ними. В реакции (2) антитела выявляют 3 разных антигена, которые образуют независимые дуги преципитации. В реакции (3) антигены имеют общий зпитоп 1, однако один из них несет еще эпитоп 2. [c.528]

Следует подчеркнуть, что большинство препаратов иммуноглобулина определенного класса обычно содержит примеси Ig других классов, за исключением IgG, выделенных хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе, и IgM, выходящих в первом пике при хроматографии на сефадексе G-200. Поэтому рекомендуется проводить рехроматографию полученных препаратов на той же колонке и в тех же условиях, либо использовать какую-то иную процедуру, например электрофорез в агарозном блоке или гель-фильтрацию. Для той же цели можно применить и аффинную хроматографию на сефарозе с класс-специфической антисывороткой. Миеломные белки классов G, А и М и парапротеины при макроглобулинемии Вальденстрёма удается очистить одноэтапной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе или зональным электрофорезом, поскольку они являются основным компонентом сыворотки. Чистоту каждой фракции иммуноглобулинов исследуют с помощью иммуноэлектрофореза, двойной иммунодиффузии или радиоиммунным методом с класс- или подкласс-специфическими антисывороткамн. Чистые белки хранят при 4°С в присутствии 0,02% NaNs или замораживают растворы с концентрацией 10— 30 мг/мл. [c.72]

Степень чистоты препаратов Н- и L-цепей лучше всего определять методом электрофореза в 5%-ном полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (Weber, Osborn, 1969) или двойной иммунодиффузии со специфическими антисыворотками к Н-и L-цепям. [c.76]

Для гуморального типа иммунного ответа характерна выработка антител, которые являются показателями функциональной активности В-звена иммунной системы [87,98,99]. Общий пул иммуноглобулинов в сыворотке крови неиммунизированных крыс определяли методом двойной радиальной иммунодиффузии в агаровом геле [100-101]. В лунки 24-х луночного планшета разливали по 2 мл 1,5% агара 01 ко, лунки вырезали шаблоном. В центральную лунку разливали по 20 мкл гиперим-мунной преципитирующей сыворотки производства НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи, а в периферийные - по 20 мкл двухкратных разведении исследуемой сыворотки. После 24 часовой инкубации при комнатной температуре учитывали реакцию по количеству [c.226]

В рассмотренном методе обнаружения антигенов после электрофореза в ПААГ путем их диффузии в слой агаройы иммунная реакция следовала за окончанием этой диффузии, когда снятую с ПААГ агарозную реплику вымачивали в специфической антисыворотке. Два процесса можно совместить во времени, если антисыворотку заставить диффундировать в гель навстречу диффузии антигена из белковых зон, полученных в результате электрофореза [Grabar, Williams, 1953]. При этом можно ожидать образования полос преципитации комплексов антиген — антитело, подобно тому как это имеет место при двойной радиальной иммунодиффузии по методу Ухтерлони. Для удобства наблюдения раствор антисыворотки следует заливать не сверху, а рядом с треком электрофореза, на некотором расстоянии от него, с тем чтобы оставалась свободная полоса ПААГ, где и будет происходить диффузия антигенов и антител навстречу друг другу. Поскольку расположение полос антигенов после электрофореза заранее неизвестно, антисыворотку, очевидно, придется заливать не в лунку, а в канавку, идущую вдоль всего трека. Кроме того, антисыворотку следует вносить в такую канавку только после окончания электрофореза, иначе преждевременная диффузия антител в гель может помешать завершению процесса электрофоретического фракционирования смеси белков. [c.134]

Встречный электрофорез проводят в агаровом геле, pH которого устанавливают так, чтобы антитела (Ат) несли суммарный отрицательный заряд, а исследуемый антиген (Аг) - положительный. В электрическом поле антиген и антитела движутся навстречу друг другу и преципитируют. Принцип метода тот же самый, что и при двойной иммунодиффузии, однако чувствительность выше в 10 - 20 раз. Ракетный электрофорез позволяет количественно определять антиген в антителосодержащем геле, pH которого подбирают с таким расчетом, чтобы движения антител не происходило, а антиген нес суммарный отрицательный заряд. Линия преципитации очерчивает область в виде ракеты, длина которой пропорциональна концентрации антигена. Определить эту концентрацию можно по калибровочной кривой. Внизу справа - фотография окрашенного геля. Оба метода основаны на различии суммарных зарядов антигена и антител при выбранном pH для большинства антигенов такие различия существуют, так как антитела имеют более высокую изоэлектрическую точку (т. е. несут нейтральный заряд при более высоком значении pH, чем большинство антигенов). Если заряды антигена и антител существенно не различаются, можно химически модифицировать антиген, чтобы сдвинуть изоэлектрическую точку. Ракетный электрофорез проводят и в обратной постановке, если требуется определить концентрацию антител здесь важно подобрать правильно гель и pH для иммобилизации антигена, чтобы не нарушалась его структура и не возникло препятствий для реакции антиген-антитело. (Р - диаметр кольца преципитации.) [c.530]

В ранних работах по иммунодиффузии пользовались небольшими пробирками (одномерная диффузия). Реакцию ставили таким образом, что диффундировал либо один реагент (простая диффузия), либо оба (двойная диффузия). Но в дальнейшем все эти модификации были вытеспеньт методом двойной двумерной диффузии на пластинках геля. Общее описание этих методов дает Ухтерлони [1300]. [c.366]

Для постановки реакции двойной иммунодиффузии по Оухтерлони растопленный агаровый гель выливают тонким слоем на стеклянную пластинку и после затвердевания вырезают в нем лунки размером 2—3 мм. В лунки раздельно помещают антигены и иммунные сыворотки, которые, диффундируя в агар, образуют в месте встречи преципитат в виде белой полосы. [c.178]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология