Преципитация количественная

Высокая специфичность антител по отношению к антигену делает их гибким и действенным инструментом, который можно использовать для выявления, количественного определения и локализации множества разнообразных веществ, представляющих интерес для биолога. Но как можно обнаружить или измерить взаимодействие антитела с антигеном Начальная реакция связывания антигена с антителом-так называемая первичная реакция-может быть измерена многими различными способами. При радиоиммунном анализе, позволяющем определять даже ничтожные количества материала, известное количество радиоактивного антигена вместе со стандартным количеством антител добавляют к образцу, содержащему неизвестное количество того же антигена в нерадиоактивной форме. Немеченый антиген конкурирует с меченым за связывающие участки антител, и чем больше данного антигена в образце, тем меньше радиоактивного антигена будет связано с антителом. Свободный радиоактивный антиген можно отделить от связанного, а затем измерить количество того и другого с помощью ряда методов, использующих различия в свойствах свободных и связанных молекул один нз общих подходов состоит в осаждении (преципитации) комплексов антиген-антитело антителами к иммуноглобулинам (рнс. 17-28). [c.27]

В некоторых реакциях преципитации количественный анализ образовавшегося преципитата дает абсолютные величины содержания антигена или антител (метод количественной преципитации). Другие реакции позволяют получать лишь относительные величины (определение титра). [c.17]

В практическом отношении антитела преимущественно применялись для решения проблем идентификации и количественного определения веществ. Здесь имеется в виду использование белков как природных маркеров некоторых сырьевых материалов с целью распознавания их в продуктах питания для контроля качества. С этой целью изготовлены специфические иммунные сыворотки этих белков. Так, например, методы преципитации в геле послужили для обнаружения в пшеничной муке примесей ячменной муки [76] или в муке из твердой пшеницы примесей муки из мягкой пшеницы [90, 91]. Они могут быть использованы также для проверки отсутствия клейковины в кормовых рационах [7]. В такой стране, как ФРГ, где законодательство разрешает использовать в производстве пива только солод из ячменя и хмель, исключая особенно зерно риса и кукурузы как более дешевые источники крахмала, для контроля поступающего в продажу пива применили метод иммунохимической идентификации [98]. Иммунохимический подход (метод преципитации и RIA) также использовали для контроля запрещаемых законом в некоторых странах добавок в пиво препаратов протеаз как средства стабилизации [32]. В этих двух последних случаях проблема распознавания сложна, поскольку изготовление пива предусматривает вспенивание сусла при перемешивании, пастеризацию при стерилизации, т. е. происходит в условиях денатурации белков. Задача распознавания денатурированных бел- [c.112]

Двумя наиболее важными иммунологическими методиками, полезными для характеристики биохимических препаратов, являются иммунодиффузия и количественная преципитация. Оба метода требуют наличия соответствующих антисывороток первый метод более прост. Его практическая сторона [c.52]

В ряде вопросов, например при выяснении родства между белками, при сравнении фракций патологических и нормальных белков и т. д., перекрестные реакции оказывают существенную пользу. Реакции преципитации весьма чувствительны. Например, с помощью антисыворотки соответствующего титра можно обнаружить овальбумин в концентрации 1 мкг/мл. В зависимости от используемого метода определения азота в количественной реакции преципитации удается обнаружить от 75 до 125 мкг антигенного азота. [c.16]

Иммунохимические методы, основанные на реакции преципитации, очень удобны для качественного и количественного анализа белков, для определения гомогенности белковых препаратов и наличия в них примесей, а также для идентификации компонентов белковых смесей. Как вспомогательный метод реакция преципитации применяется для изучения структуры белка. Преимущество этого метода по сравнению с другими состоит в том, что он может быть использован тогда, когда нельзя провести количественный химический анализ, например при определении данного компонента в смеси белков. Именно в этих случаях результаты, полученные с помощью иммунохимических реакций, могут быть очень полезны. [c.17]

Примечание. При использовании биуретового реактива в количественной реакции преципитации (см. стр. 125) удобно ставить реакцию в центрифужных пробирках на 8 мл, имеющих отметку [c.69]

Для успешного проведения ряда иммунохимических исследований необходимо, чтобы реакция преципитации осуществлялась в так называемой зоне эквивалентности, т. е. при оптимальных количественных соотношениях антигенов и антител, вступающих в реакцию. С помощью метода разведений, описанного выше, эту зону можно определить следующим образом. Готовят ряд двукратных разведений иммунной сыворотки в объеме 0,2—0,5 мл и в каждую пробирку вносят равный объем раствора антигена в том разведении, при котором еще происходит реакция преципитации. Пробирки инкубируют при 37°С в течение 60 мин, оставляют на ночь в холодильнике и учитывают реакцию на следующий день. [c.122]

Область применения. Предварительное определение зоны эквивалентности необходимо для постановки количественной реакции преципитации (см. стр. 125) и иммуноэлектрофореза (см. стр. 137). [c.123]

Результаты количественной реакции преципитации можно выразить графически, построив кривую зависимости количества азота преципитата от количества добавляемого антигена. Полученную кривую можно разделить на три части. Первая часть кривой — зона избытка антител. В соответствующих пробирках комплексы антиген — антитело образуют преципитат, который осаждается центрифугированием, а в надосадочной жидкости можно обнаружить свободные молекулы антител. Вторая часть кривой (ее вершина) — зона эквивалентности. Надосадочная жидкость в соответствующих пробирках не содержит ни свободного антигена, ни свободных антител. Третья часть кривой — зона избытка антигена надосадочная жидкость в соответствующих пробирках содержит несвязанные молекулы антигена. С увеличением количества добавляемого антигена количество азота преципитата начинает уменьшаться. Дальнейшее увеличение концентрации антигена может привести к еще большему растворению преципитата вплоть до полного перехода его в раствор. [c.126]

Метод преципитаций на бумаге оправдал себя при изучении белковых антигенов, т. е. любых белков, при введении которых образуются антитела. Однако он оказался менее удобным для количественного определения самих антител, хотя подобное определение возможно [7, 8]. [c.363]

В основе всех иммунологических реакций лежит один и тот же первичный процесс соединения антигена с антителом. Преципитация, агглютинация, цитолиз и другие более сложные реакции являются вторичным выражением этого процесса. Самой простой из всех реакций антигена с антителом является реакция преципитации растворенного антигена соответствующим антителом. Используя антигены, содержащие окрашенные группы, изотопы или какие-нибудь легко определимые химическим путем элементы, можно провести количественный анализ преципитата и установить его состав при различных условиях. Подобные исследования были проведены многими авторами, использовавшими такие меченые антигены, как гемоглобин, иодированные белкИ, фосфопротеиды, азобелки и гемоцианин. [c.342]

При контроле перекрестных реакций и неспецифической преципитации необходимо принимать меры предосторожности, в связи с чем желательно применять количественные методы [43]. [c.23]

Известная методика количественного определения преципитации антигена антителом была распространена и на взаимодействие конканавалина А с полисахаридами. Определение проводится следующим образом. К одинаковым навескам конканавалина А, находящегося в центрифужных пробирках, добавляют возрастающее количество активного сахарида осадки отделяют центрифугированием, промывают и разрушают 7 н. серной кислотой при 110°С. Углеводы окисляют, добавляя к смеси 30%-ную перекись водорода. Количественное определение образующегося сульфата аммония можно проводить различными способами. Авторы главы отдают предпочтение модифицированному [48] методу Розена [47]. [c.94]

Количественный анализ преципитации [c.54]

Так как реакция антиген-антитело основана на формировании крупномолекулярного комплекса согласно уравнению (2), то очевидно, что из-за отсутствия точной стехиометрии реакции эти методы не могут обеспечить количественное определение веществ. Поэтому методы агглютинации и преципитации относятся к качественным или полуколичественным. [c.106]

Рис. 55. Реакция количественной преципитации

Указанное уравнение основано на законе действующих масс. Оно применимо для описания реакции количественной преципитации только в зоне избытка антител и точке эквивалентности. [c.252]

Реакция количественной преципитации является первой иммунологической реакцией, учет результатов которой является строго количественным, поскольку без количественного учета реакций невозможно введение химических представлений в любую биологическую дисциплину. [c.252]

Несмотря на то что методы преципитации в геле занимают значительное место в изучении и количественном определении антигенов, а также широко применяются для контроля специфичности и определения титра преципитирующих антител, предел чувствительности данных методов составляет около 5 мкг/мл, и их невозможно использовать для количественного определения антигенов небольшой мол. массы, которые образуют только нерастворимые комплексы. По этой причине возникла необходимость в разработке альтернативных методов количественного определения антигенов. В 1945 г. Кумбс и сотр. [c.12]

Количественная реакция преципитации определяют абсолютное количество антител в преципитате, полученном при оптимальных соотношениях реагентов (кн. 2). [c.94]

II. Титрование антисывороток с использованием контрольных реагентов (ОРИД). Данный метод наиболее удобен для количественного определения IgG, полученного путем хронической иммунизации лабораторных животных. Такие антитела должны образовывать с антигеном одно кольцо преципитации. Кроме того, метод можно использовать и для повседневного тестирования сывороток пациентов с целью выявления антител к инфекционным агентам. Правда, в ряде случаев чувствительность метода недостаточна. [c.209]

Попытки разработать методы иммунодиффузии, позволяющие количественно оценивать содержание антигенов и антител, делались неоднократно. Одна группа таких методов основьгоается на двойной диффузии в геле по Ухтерлони (см. стр. 131), другая — на измерении скорости диффузии и степени мутности полос преципитации при иммуноэлектрофорезе (стр. 137). Пока эти методы еще не получили широкого распространения. [c.157]

После затвердения агара в геле вырезают лунки и заполняют их раствором антигена или антисыворотки. Диффундируя в геле, антиген или антитела встречаются с соответствующим специфичес-, КИМ партнером, что приводит к весьма быстрому появлению колец преципитации вокруг лунок. Реакцию можно учитывать уже через 30 мин, но окончательную оценку следует проводить через 24 ч инкубации при 37°С во влажной камере. Ошибка этого метода количественного определения антигенов й антител составляет 25%. Точность метода повышается, если ставить много параллельных проб. [c.158]

Образование антител можно исследовать количественно с помощью реакции преципитации. Животное, которое служит реципиентом-обычно это кролик,-иммунизируют каким-либо специфическим чужеродным белком, например яичным альбумином из куриньк яиц. Затем сыворотку крови иммунизированного животного антисыворотку), содержащую антитела, смешивают с небольшим количеством антигена, т.е. яичньш альбумином. При этом происходит помутнение, так как образуется осадок (преципитат), содержащий комплекс антиген-антитело. Если же с антигеном смешивается сыворотка неиммунизирован-ного животного, никакого осадка не образуется. [c.157]

Как и следовало ожидать, исходя из материала, изложенного в предыдущих главах этой книги, наиболее ценным способом получения сведений о концевых сахарах этих антигенов оказалось применение реакции задержки. Штауб и сотр. [21,24 ] использовали возможность количественного определения степени подавления в реакциях преципитации раство [c.136]

Детали этого метода описаны Кабатом и Мейером [66, 77]. Если можно получить сильные осаждающие антисыворотки, химический анализ преципитата гликопротеин — антитело может дать полезные сведения. Если гликонротеин гомогенен, то весь его гексозамин, гексозы, фукоза и сиаловые кислоты должны быть найдены в иммунном осадке (после поправки на растворимость осадка и если антитело присутствует в избытке). Ценность этой методики для гликонротеинов ясна в противоположность простым белковым антигенам гликонротеины могут содержать значительные количества таких легко определяемых компонентов, которые иммунный у-глобулин содержит только в небольших количествах [78—81]. Естественно, если препарат содержит несколько антигенных компонентов и антисыворотка содержит антитела ко всем этим компонентам, количественный анализ преципитации может указывать на гомогенность, хотя образец загрязнен. При таких обстоятельствах полная кривая осаждения даст большую информацию, и ингибирование осаждения низкомолекулярными веществами (если они доступны) также иногда можно использовать, чтобы отличить гомогенные препараты от гетерогенных. [c.54]

Кроме метода титрования существуют и другие способы количественного определения антигенов путем иммуноэлектрофореза. Был описан метод, основанный на принципе простой иммунодиффузии f80, 81, 1962], при которой углубления для антигенов и антител примыкают непосредственно друг к другу. Антиген, находящийся в одной части геля, диффундирует в другую, содержащую антитела, и на границе этих двух частей образуется линия преципитации. Первичная зона преципитации растворяется затем в избытке антигена, продолжающего поступать благодаря диффузии в ту часть геля, где находятся антитела. Растворимые комплексы антиген-антитело вновь преципи-тируют при реакции с антителами в прилежащей зоне геля. Описанная последовательность событий — преципитация, растворение и повторная преципитация — создает впечатление, что преципитат движется. Путь, пройденный передним краем преципитата за тот или иной период времени, может служить мерой для определения концентрации антигенов. При этом в качестве стандартов необходимо использовать образцы с известной концентрацией антигена. При количественном иммуноэлектрофорезе для проведения простой иммунодиффузии разделенных компонентов в геле вырезают широкую канавку, непосредственно примыкающую к лунке с антигеном (рис. 85), и заполняют [c.240]

Электроиммуноанализ проводится следующим образом. Готовят 0,8—1,5%-ный золь агарозы в соответствующем буфере. После охлаждения золя до 45—55 °С его смешивают с антисывороткой или с выделенными антителами и формируют слой геля толщиной 1 — 1,5 мм. С этой целью теплый золь агарозы выливают на стеклянную пластинку, установленную строго горизонтально, или заливают агарозу в форму, образованную двумя стеклянными пластинками и U-образной рамкой. Рамку оставляют между стеклами до завершения электрофореза, но ее можно удалить и залить освободившееся пространство агарозой. Как правило, требуется сравнительно небольшое количество антисыворотки, но оно, естественно, зависит от ее титра. Для количественного анализа наиболее удобны пики преципитации высотой 20—30 мм. Работать следует с самым большим разведением антисыворотки, при котором еще возможно образование видимого преципитата. Разведение антигена должно быть подобрано соответствующим образом. Если исследуют антигены с мол. массой более 200000, то в этом случае особенно важно разбавлять реагенты до такой степени, чтобы происходила лишь слабая преципитация, поскольку крупные комплексы таких антигенов с антителами могут забивать поры в геле, что [c.248]

Строго говоря, площадь под пиком преципитата пропорциональна количеству внесенного антигена и обратно пропорциональна концентрации антител в геле. Если допустить, что высота пика преципитата пропорциональна его площади, то можно с достаточной точностью определить количество антигена путем измерения расстояния от верхнего края лунки до вершины пика. Для получения калибровочной кривой на гель наносят ряд стандартных антигенов с известной концентрацией. Сколари и др. [1156] обнаружили, что линейная зависимость между площадью пика и количеством антигена сохраняется в более широком интервале концентраций антигена по сравнению с такой же зависимостью между концентрацией антигена и высотой пика. Точность метода зависит от того, насколько близки между собой размеры молекул и величина зарядов исследуемых и стандартных антигенов. Воспроизводимость количественных определений наиболее высока в том случае, когда образуются симметричные пики преципитации с отчетливыми внутренними и внешними границами. Стандартная ошибка может при этом составлять 2—5%, несколько превышая ошибку, которую дает простая радиальная иммунодиффузия при оптимальных условиях [807]. [c.250]

Описанный метод используют главным образом для одновременного количественного определения всех компонентов какой-либо гетерогенной смеси. Для этой цели нужна антисыворотка, содержащая антитела ко всем анализируемым компонентам, причем титр этих антител должен быть достаточно высоким, чтобы образовались преципитаты, поддающиеся измерению. Подобную сбалансированную антисыворотку трудно получить путем иммунизации. Ганрот [424] предлагает готовить антисыворотки высокого титра для нескольких антигенов, а затем смешивать их в таком соотношении, при котором обеспечивается адекватное содержание антител для каждого антигена. Очевидно, более выгодно использовать при перекрестном иммуноэлектрофорезе смесь антигенов в двух разных концентрациях [1017]. Само количественное определение заключается в измерении площадей под пиками преципитации. Его можно провести с помощью полуавтоматического электронного планиметра [873, 1386]. Другой способ состоит в том, что пластинку проецируют на лист белой бумаги, пики обводят карандашом, вырезают и взвешивают. Если методика электрофореза отличается высокой [c.256]

Приведенные выше расчеты основаны па теории количественной преципитации, разработанной М. Гейдель-бергером и Д. Кендаллом. Ими впервые доказано, что в состав преципитата ие вовлекаются никакие сывороточные белки, за исключением антител. Разумеется, в состав преципитата могут быть вовлечены компоненты системы комплемента lq и СЗЬ. Чтобы исключить это, из сыворотки предварительно удаляют комплемент (например, другим иммунным комплексом) или инактивируют его прогреванием сыворотки при 56"С в течение 30 мин. [c.252]

Количественный вариант реакции связывания комплемента в одной из принятых модификаций (И. Тарханова, А. Коников, 1957) основан на связывании комплемента в зоне эквивалентности системы антиген-антитело. К равным количествам антител добавляют антиген в возрастающей концентрации и ко.мплемент. Пробы оставляют на 1 ч при 37°С или на 18 ч при О С. Затем в каждой пробе определяют количество свободного комплемента по способности последнего лизировать эритроциты барана, сенсибилизированные IgG-антителами кролика против эритроцитов барана. Количество связанного комплемента выражают в СН50, т. е. количестве комплемента, необходимом для 50%-ного гемолиза сенсибилизированных антителами эритроцитов. Если выразить графически зависимость между количеством антигена в пробе и количеством связанного комплемента, полученная экспериментальная кривая окажется подобной кривой, описывающей зависимость между количеством белка преципитата и количеством добавленного антигена (см. рис. 55 и 59). В одной и той же системе антиген-антитело соотношение реагентов, соответствующее образованию максимального количества преципитата, с одной стороны, и максимальному количеству связанного комплемента, с другой, обычно совпадают. Однако в отличие от реакции преципитации РСК чувствительнее по меньшей мере в 50—100 раз, т. е. во столько раз можно развести анти- [c.259]

Принцип совмещения электрофоретической миграции антигена в агаре с его преципитацией под действием антител был развит в 1966 г. Лореллом [И], который разработал метод ракетного иммуноэлектрофореза для быстрой оценки количества индивидуальных антигенов в смеси с помощью моноспецифических антител, введенных в гель, а также двумерный (перекрестный) иммуноэлектрофорез, позволяющий оценить как качественный, так и количественный состав сложной смеси антигенов с помощью полиспецифических антисывороток. [c.12]

Молекулы (В растворе, помещенные в лунки агарового геля, радиально диффундируют и образуют иммунные комплексы с комплементарными молекулами антител или антигенов, содержащихся IB жидкой фазе агара. В стандартной РИД агар содержит моноспецифические антитела, а радиально диффундирующий антиген, встречаясь с ними, образует кольцо преципитации. До тех пор пока в лунке сохраняется избыток антигена, процсходит постепенное увеличение диаметра кольца преципитации. Реакция протекает в течение нескольких дней, причем время проведения определяется молекулярными размерами антигена. В случае IgM (мол. масса 900 000) времени требуется по крайней мере вдвое больше, чем для IgG (мол. масса 150 000). На практике, если молекулы имеют размер IgG или менее, для построения количественной кривой с использованием Стандартных разведений антигена достаточно 24-часо-вой инкубации при 4°С или 16-часовой при комнатной температуре. Количественная оценка основана на том, что размеры кольца преципитации прямо пропорциональны количеству антигена IB лунке ( при равных объемах препаратов в лунках). По квадрату диаметра колец преципитации (D ) можно судить о соотношении концентраций антигена в лунках даже при сокращении времени инкубации. Для построения калибровочной кривой используют стандартные разведения антигена, концентрация которых отличается в 10—20 раз и может достигать 5 м кг/мл. Образцы соотносят с калибровочной кривой, измеряя размеры кольца преципитации на еще влажном геле. [c.208]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология