Регенерация растений из протопластов

Изолированные протопласты можно культивировать. Обычно для этого используют те же среды, на которых растут изолированные клетки и ткани. Сразу же после удаления ферментов у протопластов в культуре начинается образование клеточной стенки. Протопласт, регенерировавший стенку, ведет себя как изолированная клетка, способен делиться и формировать клон клеток. Регенерация целых растений из изолированных протопластов сопряжена с рядом трудностей. Получить регенерацию через эмбриогенез удалось пока только у растений моркови. Стимуляцией последовательного образования корней и побегов (органогенез) добились регенерации растений табака, петунии и некоторых других растений. Следует отметить, что протопласты, изолированные из генетически стабильной клеточной культуры, чаще регенерируют растения и с большим успехом используются при исследованиях генетической модификации протопластов. [c.178]

Регенерация растений из протопластов [c.384]

Рис. 5.4. Схема регенерации растений из изолированных клеток или протопластов

Каллусная ткань представляет собой легко доступный материал, который наиболее часто используют для клеточной селекции. Как правило, работу проводят на первичной или пересадочной каллусной ткани, которая не утрачивает способности к регенерации на протяжении ряда субкультивирований. Однако при работе с каллусными культурами многие исследователи отмечают существенные недостатки данного объекта медленный рост ткани, неравноценное для всех клеток действие токсических веществ, которые применяются в качестве селективного фактора, а также потеря регенерационной способности в процессе культивирования каллусных клеток. Несомненно, проводить селекцию целесообразно на уровне одиночных клеток (суспензионная культура, протопласты). Однако для многих видов растений не разработаны эффективные технологии и способы культивирования одиночных клеток. Поэтому, несмотря на перечисленные выше недостатки использования каллусных культур, этот способ селекции остается для некоторых видов растений пока единственным. [c.143]

По общему мнению, наибольший вклад биотехнологии в сельское хозяйство следует ожидать за счет улучшения свойств самих растений путем использования методов рекомбинантных ДНК и протопластов растений. Применительно к бобовым и злакам метод регенерации целых растений из отдельных клеток не дал пока сколько-нибудь значительных результатов. Однако работа с люцерной была небезуспешной, и это позволяет надеяться, что опыты с бобовыми тоже будут более результативными по мере разработки все более подходящих условий культивирования. Применяя подобную технологию, быть может, удастся получить белки злаков, содержащие незаменимые аминокислоты, которых сейчас в них нет. [c.28]

Рис. 16.3. Протопласты, выделенные нз листьев картофеля, можно использовать для регенерации целых растений (Л).

Другой способ — применение методов генетической инженерии для создания растений, способных к азотфиксации. Предлагается переносить гены азотфиксации (га -гены) от микроорганизмов, фиксирующих азот, непосредственно в злаковые или другие экономически важные виды растений. По мнению специалистов, эта процедура методически вполне осуществима ш/-ген может быть введен в протопласты растений с помощью определенных векторов (таких, как плазмиды бактерий, патогенных для растений, или вирусы растений). Последующее культивирование протопластов и их регенерация до целых растений позволили бы получить особи, которые несли бы введенную генетическую информацию в своих клетках и, возможно, в последующих поколениях благодаря передаче через семена. [c.55]

Регенерация обычно с трудом происходит из трансформированных недифференцированных тканей, полученных из культивируемых более нескольких месяцев клеток суспензии, а еще с большим трудом из каллусов, полученных из протопластов [3, 28]. Таким образом, прежде чем осуществлять трансформацию любой разновидности растений, чрезвычайно важно определить наиболее чувствительный эксплантат. Для. многих культурных видов главной трудностью остается трансформация клеток, способных регенерировать побеги ( органогенез ) или способных к эмбриогенезу, и поэтому большинство методов разработано в результате экспериментов на модельных системах культуры тканей, таких, как табак и петуния. Для ясности большинство из рассматриваемых ниже методик основано на использовании именно таких модельных систем. В целом все основные манипуляции с культурой ткани должны быть действенными для успешной разработки системы трансформации конкретных видов растений. Информация относительно культивирования тканей многих видов содержится в следующих литературных источниках [4, 24, 25, 26, 70, 83]. [c.105]

Клетки считаются компетентными для трансформации, когда в них начинается репликация ДНК. Синтез ДНК во многих системах протопластов начинается одновременно с регенерацией клеточной стенки во время первого деления, но такие клетки, как правило, слишком слабые, чтобы пережить совместное культивирование с агробактериями. Во многих случаях целесообразно инокулировать культуры агробактериями, когда большинство клеток в популяции вступает во второй период синтеза ДНК перед вторым делением. В случае мезофильных протопластов табака, выделенных из тепличных растений, эта стадия наступает через 6—8 дней культивирования. [c.153]

Полученные тем или иным путем протопласты либо используют для регенерации растения (см. тотипотентность), либо их можно подвергнуть слиянию с образованием гетерокариотических гибридов. [c.516]

Регенерация клеток, клеточных культур и растений из протопластов. Образование клеточной стенки у протопластов в культуре происходит сразу после удаления раствора фермента. Вновь синтезируемую клеточную стенку можно наблюдать в флуоресцентный микроскоп, используя как реагент калкофлер белый (1%-ный раствор). Регенерация клеточных стенок — явление достаточно распространенное. Гораздо труднее добиться деления образующихся клеток и еще труднее получить целое растение. Однако для ряда видов имеются устойчивые пинии клеток и целые растения (см. Ю. Ю. Глеба, К. М. Сытник, М984). Возможность регенерации растений из протопластов мо ет свидетельствовать о тотипотентности протопластов, как это было показано для клеток растений (F. Steward, 1970). I [c.38]

Еще один представитель пасленовых Petunia обладает достаточно высоким регенерационным потенциалом и широко используется в экспериментальных исследованиях. Интересно, что состав среды, на которой происходит образование проростков и корней, сходен и у табака, и у петуньи. Формирование каллуса и регенерация растений получена из протопластов рапа Brassi a napus. [c.41]

Культура изолированных органов, тканей и клеток растений в настоящее время находит все большее применение в биологических исследованиях. Такие методы, как клональное микроразмножение растений, оздоровление от вирусной инфекции с помощью культуры апикальных меристем, регенерация растений из каллусных культур, находят сейчас практическое применение. Существенную помощь методы культивирования in vitro могут оказать генетикам и селекционерам в получении новых форм растений. Используя гаплоиды, незрелые или нежизнеспособные зародыши гибридов, сомаклональные варианты растений-регенерантов, биотехиологи вместе с селекционерами ускоряют и облегчают селекционный процесс. Более сложная техника манипулирования с клетками растений необходима для получения соматических гибридов слиянием протопластов или для генетической трансформации клеток и растений. [c.232]

В последние годы достигнуты большие успехи, связанные с генетической трансформацией клеток, в том числе и растительного происхождения. Схема трансформации включает в себя получение протопласта, введение в него необходимой генетической информации, формирование полноценной растительной клетки, клонирование и регенерацию. (Подробно техника генно-и1гженерных экспериментов будет описана в следующем разделе.) В данной схеме трансформированный протопласт — суспензионная культура — каллусная культура — целое растение (рис. 31.4) — наиболее тех- [c.498]

При инкубации протопластов на твердой среде В или на модифицированной твердой среде происходит регенерация клеточных стенок и ограниченное деление клеток, в результате чего образуются микрокаллусы. После переноса в среду С они растут далее до стадии, когда становится возможным перенос в среду D, где индуцируется образование (морфогенез) побегов. На заключительной стадии каллусы с побегами длиной около 1 мм переносят на среду Е для завершения образования побегов и формирования корней. Укорененные растения пересаживают в небольшие горшочки с вермикулитом, где они и растут далее. [c.385]

Здесь изложена суть метода, который следует использовать для регенерации целых растений из одиночных протопластов, и проиллюстрировано, как экспериментатору приходится варьировать условия на разных стадиях развития, чтобы добиться успеха. На рис. 9.7—9.10 показано, как выглядят свежевыделенные протопласты, молодые каллусы и крошечные растения, регенерированные из ткани каллуса. Особенно важно в этой работе строго выдерживать надлежащие условия, однако почти наверняка их придется специально подбирать для каждого изучаемого вида растений. [c.385]

Рис, Э-Ю. Регенерация мини-растений Solanum brevidens из каллусной ткани, полученной из протопластов (снимок сделан приблизительно через 100 сут после перенесения на агаровую среду, способствующую регенерации). [c.389]

Томас и др. (Thomas et al., 1979) перечисляет ряд работ, в которых была осуществлена регенерация в экспериментах по слиянию протопластов растений, принадлежащих к одному и тому же (7 случаев) и разным (14 случаев) видам. В четырех экспериментах по межвидовому слиянию были получены линии клеток, а в четырех других — осуществлен захват клеточных [c.389]

Способность соматических клеток растений и регенерации в культуре дает возможность проводить с такими клетками разнообразные генетические манипуляции и получать трансгенные растения. Для гого чтобы облегчить попадание чужеродной ДНК в растительные клетки, их лишают жесткой оболочки. Этого можно добиться с помощью обработки клеток ферментами, гидролизующими связи в полисахаридах клеточной стенки В результате такой обработки клетки превращаются в иротоиласты (рис. 20-71). Носле введения в них чужеродной ДНК протопласты можно заставить вновь сформировать клеточную стенку, индуцировать деление и даже регенерировать новое растение [c.438]

В пределах конкретных видов для многих приложений генетической инженерии растений важно идентифицировать культивируемые растительные клетки, которые как компетентны для трансформации, так и способны регенерировать в целые растения. Эксплантаты могут варьировать по сложности от изолированных протопластов до целых проростков или фрагментов зрелых органов (рис. 2.6). Исходя из предположения, что поверхность по крайней мере некоторых клеток эксплантатов двудольных растений доступна для контакта с агробактериями и эти клетки способны делиться in vitro, при разработке системы трансформации нового растения прежде всего надо рассмотреть возможность воспроизводимой регенерации данных растений. Многое зависит от эмпирического опыта подбора подходящей среды для регенерации побегов. Однако нельзя не учитывать основную анатомию, физиологию и характер развития выбранного растения при идентификации подходящих эксплантатов для культуры ткани, которые на какой-то стадии перейдут к регенерации побегов. Без этих фундаментальных знаний поведение эксплантатов будет непредсказуемым и, следовательно, обострит любые проблемы, связанные с идентификацией, возможно, редких трансформированных тканей. Например, общие внешние условия роста донорного растения, размер эксплантата и онтогенез выбранного в качестве источника органа часто определяют последующее поведение в культуре ткани. [c.103]

В процессе образования корончатого галла агробактерии способны трансформировать клетки, прилежащие к поврежденной ткани, которые претерпевают клеточные деления в ответ на поранение. Клетки интактного растения, как правило, проявляют максимальный онкогенный ответ на инфекцию А. tumefa iens между 1,5 и 3 днями после поранения. У различных видов эта компетентная фаза совпадает с первыми клеточными делениями в ответ на поранение. Как было показано [50], раневой ответ можно имитировать в культуре тканей, если превратить покоящиеся мезофильные клетки листа или активно делящиеся клетки суспензионной культуры в протопласты и индуцировать регенерацию клеточной стенки и клеточное деление в соответствующей среде. В определенной фазе становления культуры протопластов клетки компетентны для трансформации Л. tumefa iens. Технология совместного культивирования предусматривает инкубацию протопластов в присутствии агробактерий в соответствующей жидкой питательной среде и позволяет получать большое число трансформантов в контролируемых условиях, Варьируя условия культивирования, плотность высева и изменяя процедуру селекции, можно получить трансформированные колонии клонального происхождения. Важно иметь в виду, что корончатые галлы — это смесь нетрансформированных и различных типов независимо трансформированных клеток и, следовательно, фенотип галла представляет собой сумму фенотипов всех клеток, обнаруживаемых в опухоли. Однако клеточная популяция трансформантов, полученных с помощью сов- [c.151]

Неудачи в экспериментах по трансформации культурных видов растений, как правило, обусловлены трудностями в их культивировании in vitro и не связаны с неадекватностью векторной конструкции. Трансформация протопластов имеет ограниченное применение, поскольку только немногие экономически важные виды можно легко регенерировать из тканей, полученных из протопластов. Однако у многих сельскохозяйственных растений возможна регенерация из каллуса и клеток суспензионной культуры как путем органогенеза [28], так и соматического эмбриогенеза [3]. Поэтому предпринимаются большие усилия по разработке эффективных систем трансформации для этих тотипотентных клеток культурных растений [5, 62, 65]. [c.160]

Чтобы упростить манипуляции с ДНК и частично решить проблему ограничения круга хозяев, растительные протопласты трансформируют путем непосредственного введения векторнок ДНК. Однако сразу же следует подчеркнуть, что, хотя в настоящее время теоретически возможна трансформация практически любой системы протопластов, проблема регенерации трансформированных растений из полученных на основе протопластов тканей окончательно не решена. Поэтому трансформация протопластов имеет ограниченное применение (некоторые возможности ее использования обсуждаются ниже) [c.196]

Не все виды растений способны к регенерации, и до недавнего времени считалось, что их дифференцированные клетки лишены этой способности. Работы по гибридизации клеток заставили изменить это мнение. С помощью определенных ферментов можно без труда выделить из листьев протопласты, т. е. отдельные клетки без клеточных стенок. Если такие клетки гибридизовать с другими клетками или просто оставить в культуре, то протопласты восстанавливают свои клеточные стенки и при помещении в соответствующую среду формируют целые растения. Такая регенерация была получена на нескольких видах, в том числе на петрушке, табаке и картофеле (Dudits et al., 1980 Shepard, 1982). Как и у бегонии, новой зародышевой плазме, а затем цветкам и гаметам дают при этом начало единичные, полностью дифференцированные соматические клетки листа. [c.301]

В жидкой среде под действием пектиназ каллус распадается на изолированные клетки. Взятые отсюда отдельные клетки на плотной среде после ряда делений вновь образуют каллус, из которого в ряде случаев (клетки табака, моркови, петунии, томата, картоЛеля) удается получить целое растение. Целое растение можно получить даже из протопластов, т. е. из клеток, не имеющих клеточных стенок. Протопласты получают из многих видов растений. Лучщим их источником служат клетки молодых листьев, которые сначала обрабатывают пектиназами для удаления межклеточных связок, а затем целлюлазами для удаления самой клеточной стенки. После этого ихпомещают на плотные среды, где через 5— 10 дней происходит регенерация клеточной стенки и начинается деление клеток. Дальнейшее развитие процесса идет стандартным [c.139]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология