Глицеральдегид фосфатдегидрогеназа

Рис. 15-7. А. Схема, поясняющая механизм действия глицеральдегид-З-фосфатдегадрогена-зы. Между субстратом и 8Н-группой в активном центре фермента возникает ковалентная связь - образуется тиополуацеталь. Этот промежуточный продукт, представляющий собой фермент-субстратный комплекс, окисляется за счет NAD , который также связан с активным центром фермента в результате образуется тиоэфир-ковалентный промежуточный продукт, называемый ацилферментом. Связь между ацильной группой и тиоловой группой фермента характеризуется очень высокой стандартной свободной энергией гидролиза, последнем этапе тиоэфирная связь претерпевает фосфоролиз, в результате чего происходит регенерация свободного фермента и образуется ацилфосфат, сохраняющий в себе значительную часть энергии, высвободившейся при окислении альдегидной группы. Б. Иодацетат является мощным ингибитором глицеральдегид-фосфатдегидрогеназы, потому что он образует ковалентную связь с важной функциональной 5Н-группой фермента и таким образом инактивирует фермент.

Работа 134. Обнаружение дегидрогеназы 3-фосфоглицеринового альдегида (глицеральдегид-фосфатдегидрогеназы) [c.178]

Механизм действия глицеральдегид-фосфатдегидрогеназы довольно сложен (рис. 15.7). Сначала субстрат взаимодей- [c.451]

Активность альдолазы может быть измерена двумя методами химическим, основанным на определении концентрации продуктов реакции — фосфотриоз (по нарастанию щелочнолабильного фосфорл), и энзиматическим, в сопряженной системе, содержащей помимо альдолазы и фруктозо-1,6-дифосфата также НАД+ и глицеральдегид-З-фосфат-дегидрогеназу или НАДН и глицерол-З-фосфатдегидрогеназу. Скорость альдолазной реакции определяют по нарастанию или убыли НАДН. [c.246]

Определение активности глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназы [c.253]

Выделение глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназы [c.256]

Раствор глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназы из дрожжей или скелетных мышц кролика в буфере А — концентрация [c.297]

Активность фосфоглицераткиназы определяют в сопряженной системе в присутствии избытка глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназы по уменьшению концентрации НАДН. [c.299]

Раствор глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназы — 300 ед/мл (2—5 мг/мл). [c.300]

Суспензия глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, связанной с сефарозой через 1 субъединицу. [c.301]

Для получения растворимых денатурированных субъединиц апо-фермент глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназы из дрожжей в концентрации 2,5—3,5 мг/мл инкубируют в течение 1 ч в 8 М растворе мочевины (за полнотой денатурации следят по изменению активности фермента). Полностью денатурированные субъединицы добавляют к суспензии иммобилизованных мономеров в 8-кратном избытке по отношению к связанному с сефарозой белку. Эту процедуру проводят трижды с 30-минутными интервалами между добавками при постоянном перемешивании и температуре 25° С. Несвязавшийся белок отмывают 0,1 М Ма-фосфатом. Определяют содержание белка и активность в препарате после реассоциации. [c.303]

Антисыворотка, полученная у кроликов, иммунизированных глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназой из дрожжей. [c.304]

ИММОБИЛИЗАЦИЯ ГЛИЦЕРАЛЬДЕГИД-З-ФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ [c.383]

Эти ферменты окисляют альдегиды и кетоны до кислот. Например, глицеральдегид-фосфатдегидрогеназа (К.ф.1.2.1.12) окисляет 3-фосфоглицериновый альдегид в 1,3-дифосфоглицериновую кислоту с з астием НАД. [c.120]

Наблюдаемые различия в структуре ферментов можно объяснить в основном дивергентной эволюцией родоначальной формы. Различие в аминокислотной последовательности данного фермента в случае родственных видов может быть весьма незначительным и очень мало сказываться на его специфичности и каталитической активности. Однако в случае неродственных видов такие различия бывают более существенными, хотя фермент по-прежнему выполняет ту каталитическую функцию, по которой его определяют и дают название. Степень гомологичности между аминокислотными последовательностями разных форм фермента в таких случаях весьма невелика, и более информативным становится сравнение трехмерной структуры, определяемой с помощью рентгеноструктурного анализа кристаллов фермента. Концепция эволюционной дивергенции была применена к семьям родственных ферментов, таких, как сери-новые протеиназы поджелудочной железы, NAD-зависимые дегидрогеназы [435, 3649]. Анализ аминокислотных замен помог установить, какой из остатков важен для активности фермента или его специфичности. Рентгеноструктурный анализ показал, что у лактат-, малат-, алкоголь- и глицеральдегид-фосфатдегидрогеназ строение коферментсвязывающих участков весьма сходно (см. с. 669—671), но субстратсвязывающие участки и остальные части молекулы ферментов различаются. [c.105]

Расщепление фруктозо-1,6-дифосфата на две фосфотриозы катализирует альдолаза (КФ 4.1.2.13). При этом образуется глицеральдегид-3-фосфат и диоксиацетонфосфат. Альдолаза мышц не требует для проявления ферментативной активности ионов металлов или каких-либо кофакторов. При исследовании превращения фруктозо-1,6-дифосфата в качестве источника альдолазы используют диализованные экстракты мышц. В процессе диализа из экстракта удаляются компоненты адени-ловой системы НАД и неорганический фосфат, в отсутствие которых становится невозможным дальнейшее превращение глицеральдегид-З-фосфата под влиянием глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназы. Альдолаза относительно термостабильна. Ферментативное расщепление фруктозо-1,6-дифосфата обратимо, положение равновесия с повышением температуры смещается в сторону образования фосфотриоз, константа равновесия при этом возрастает. [c.63]

Иммобилизацию фосфоглицераткиназы проводят, как описано выше, используя препараты сефарозы, активированные 30 мг Br N на 1 г геля. Препараты иммобилизованной фосфоглицераткиназы могут быть использованы для синтеза 1,3-дифосфоглицерата и для определения активности глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназы в реакции восстановительного дефосфорилирования 1,3-дифосфоглицерата. [c.303]

Определение активности альдолазы этим способом основано на лрименении сопряженной системы, в которой в качестве вспомогательного фермента используется глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназа (ГАФД) [c.247]

Глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназа. Кристаллическую суспензию растворяют в 5 мМ ЭДТА (pH 7,5) до получения раствора, содержащего 10 единиц активности/0,1 мл (см. также с. 253). [c.248]

В спектрофотометрическую кювету помещают 2 мл 0,1 М триэта- ноламинового буфера, pH 8,0, глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназу (30 единиц активности), а также растворы фруктозо-1,6-дифосфата (0,2 мМ), НАД+ (3 мМ) и арсената натрия (5 мМ) с таким расчетом, чтобы после доведения объема пробы до 3 мл их конечные концентрации соответствовали величинам, указанным в скобках. После переме-щивания начинают реакцию добавлением 30—50 мкл раствора альдолазы. Отмечают нарастание поглощения при 340 нм. [c.248]

Триозофосфатизомераза пивных дрожжей имеет молекулярную массу 53 000 Да, состоит из двух неидентичных субъединиц. Оптимум pH в триэтаноламин-НС1-буфере — 7,0—8,5 и 7,6—9,5 соответственно при определении активности с использованием в качестве вспомогательного фермента глицерол-З-фосфатдегидрогеназы или глицеральде-гид-З-фосфатдегидрогеназы. Константа равновесия реакции изомеризации D-глицеральдегид-З-фосфата при pH 7,5 и 25°С равна 19. Кт для этого субстрата при тех же условиях — 1,27x10 М, а для диоксиацетонфосфата — 1,23X10 М. Л ° 1см при 280 нм равна 9,9. [c.249]

Активность триозосфосфатизомеразы можно измерять по убыли или образованию НАДН в зависимости от того, используется ли в качестве субстрата глицеральдегид-З-фосфат, а в качестве вспомогательного фермента — глицерол-З-фосфатдегидрогеназа или соответственно диоксиацетонфосфат и глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназа. В обоих случаях за ходом реакции следят спектрофотометрически, определяя изменение оптической плотности при 340 нм (с. 7). [c.249]

В спектрофотометрическую кювету помещают реакционную смесь содержащую (указаны конечные концентрации) 80 мМ буфер, 0,25 мМ НАДН, 0,1 мл глицеральдегид-З-фосфата и 0,05 мл глицерол-З-фосфатдегидрогеназы. Перемешивают и устанавливают величину оптической плотности при 340 нм по шкале спектрофотометра на отметке 0,4—0,5. Добавляют 0,05 мл триозофосфатизомеразы (общий объем пробы — [c.250]

Глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназа (освобожденная от сульфата аммония), не содержащая триозофосфатизомеразы и глицерол-З-фосфатдегидрогеназы — 75 Е/мл, свежеприготовленный раствор на 30 мМ триэтаноламиновом буфере. [c.250]

Глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназа — тетрамер (м. м.= 144 000 Да), построенный из химически идентичных субъединиц. Центральную роль в катализе выполняет цистеиновый остаток. Фермент ингибируется ионами тяжелых металлов. Константы Михаэлиса гли-церальдегид-З-фосфатдегидрогеназы из мышц кролика для НАД+ — 13 мкМ, для глицеральдегид-З-фосфата — 90 мкМ, для фосфата — [c.253]

Активность глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназы измеряют сиектрофотометрически ио нарастанию (в прямой реакции) или по уменьшению (в обратной) поглощения при 340 нм. Ниже приводится только первый вариант. [c.253]

Получение апофермента. Для отщепления НАД+, прочно связанного с мышечной глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназой, препарат фермента обрабатывают норитом (активированный уголь), 500 мг норита суспендируют в 10 мл 10 мМ фосфата натрия, содержащего 5 мМ ЭДТА, pH 7,2. Через 2—3 мин надосадочную жидкость декантируют для удаления мелких частиц норита. Эту процедуру повторяют [c.256]

Для выполнения задач по получению иммобилизованных субъединиц глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназы и лактатдегидрогеназы иммобилизацию проводят на сефарозе, активированной низкими концентрациями Br N (3—5 мг Br N на 1 г геля). [c.298]

Иммуносорбенты на основе иммобилизованной глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы из дрожжей получают при степени активации сефарозы 150 мг Br N на 1 г геля. [c.298]

Растворимая глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназа из дрожжей при инкубации на холоде в присутствии АТФ и хлористого натрия диссоциирует на димеры и теряет свою активность. Диссоциация тетрамера иммобилизованной глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназы позволяет получить связанные с матрицей димеры и исследовать их свойства. Стабилизирующее действие носителя приводит к получению димеров, сохранивших нативную конформацию. [c.301]

Цель задачи — используя растворы мочевины разной концентрации, подобрать оптимальные условия для получения иммобилизованных мономеров глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназы и лактатдегидрогеназы и исследовать каталитические свойства этих мономеров, сравнив их со свойствами иммобилизованных форм другой степени олигомерности. [c.302]

Активность глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназы определяют, используя сопряженную систему, в которой синтез 1,3-дифосфоглицера та осуществляют с помощью иммобилизованной фосфоглицераткиназы В пробу объемом 3 мл вносят 0,1—0,3 мл суспензии иммобилизован ной глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназы и 0,1 мл суспензии нммо билизованной фосфоглицераткиназы (10—20 единиц активности) Концентрации остальных компонентов следующие НАДН — 2 м.М, [c.303]

Цель задачи — исследовать эффективность очистки антител из антисыворотки на иммуносорбентах, полученных при иммобилизации глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназы на препаратах сефарозы, активированных при разной концентрации Br N. [c.304]

Препараты сефарозы с глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназой, иммобилизованной при разной степени активации, помещают в колонки (размер 0,5x3 см) и уравновешивают 0,15 М раствором Na I. Затем при комнатной температуре через колонки пропускают антисыворотку до полного насыщения иммуносорбента антителами (т. е. до прекращения адсорбции антител на сорбенте при пропускании дополнительных порций антисыворотки). Иммуносорбент отмывают от балластных белков 0,15 М раствором Na l до исчезновения поглощения при длине волны 280 нм в элюате. [c.304]

Глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназа (ГАФД) представляет собой тетрамер, состоящий из химически идентичных субъединиц, каж- дая из которых формирует один активный центр. Тетрамерная молекула фермента построена по типу димера димеров, т. е. в определенных условиях молекула фермента диссоциирует на два равноценных димера. Это обусловлено тем, что прочность контактов между субъединицами по одной из трех осей симметрии существенно ниже, чем по двум другим, и диссоциация происходит в первую очередь в результате нарушения взаимодействия субъединиц именно по этой оси. При инкубации фермента в растворе в присутствии моновалентных анионов и адениловых нуклеотидов при низкой температуре тетрамерная молекула ГАФД диссоциирует на димеры, которые в растворе достаточно быстро теряют активность. Дальнейшей диссоциации димеров на мономеры в этих условиях не происходит. Своевременное удаление факторов диссоциации ведет к восстановлению тетрамерной структуры ГАФД и ее активности. [c.383]

Общая органическая химия Т.10 (1986) -- [ c.5 , c.5 ]

Аффинная хроматография (1980) -- [ c.302 ]

Новые методы анализа аминокислот, пептидов и белков (1974) -- [ c.350 , c.367 , c.394 , c.403 , c.405 , c.408 , c.418 ]

Механизмы биоорганических реакций (1970) -- [ c.0 ]

Неорганическая биохимия Т 1 _2 (1978) -- [ c.458 ]

Катализ в химии и энзимологии (1972) -- [ c.43 , c.130 , c.243 ]

Биохимия человека Т.2 (1993) -- [ c.183 , c.184 , c.207 , c.235 ]

Генетика человека Т.3 (1990) -- [ c.134 ]

Биохимия человека Том 2 (1993) -- [ c.183 , c.184 , c.207 , c.235 ]

Биологические мембраны Структурная организация, функции, модификация физико-химическими агентами (2000) -- [ c.82 , c.83 , c.85 ]

Основы ферментативной кинетики (1979) -- [ c.191 ]

Методы исследований в иммунологии (1981) -- [ c.117 ]

Основы биохимии (1999) -- [ c.344 , c.345 , c.346 , c.350 , c.361 , c.362 ]

Биохимия Т.3 Изд.2 (1985) -- [ c.31 , c.39 , c.40 , c.195 ]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология