Полимерные носители, синтез олигонуклеотидов

Рис. 5. Схема твердофазного синтеза олигонуклеотидов амидофосфитным методом П - полимерный носитель, Ру-пиридин.

Несмотря на применение защищенных производных нуклеотидов и нуклеозидов, некоторые побочные реакции (например, образование пирофосфатов при синтезе исходя из моноэфиров фосфорной кислоты) все же имеют место вследствие этого требуется тщательная хроматографическая очистка продуктов реакции. Одним из приемов, позволяющих существенно упростить очистку продуктов реакции, является фиксация одного из компонентов реакционной смеси на полимерном носителе Такой полимер может быть легко отделен от других компонентов реакционной смеси. Продукт реакции, фиксированный на полимере, можно подвергать дальнейшим превращениям, что значительно упрощает многостадийные синтезы. Наконец, после выполнения всех стадий продукт может быть отщеплен от полимера и выделен в чистом состоянии. Такой подход к синтезу олигонуклеотидов привлекает сейчас большое внимание . Неспецифичность химических методов создания межнуклеотидной связи, являющаяся недостатком химического подхода к синтезу олигонуклеотидов (получение защищенных производных нуклеозидов и нуклеотидов требует многостадийных синтезов), в данном случае дает ряд преимуществ, поскольку в синтез олигонуклеотидов могут быть введены самые разнообразные производные нуклеозидов, в том числе и синтетические аналоги компонентов нуклеиновых кислот. Это открывает широкие возможности исследования связи структуры и функции природных полинуклеотидов. [c.86]

Синтез на полимершх носителях. Так же как и в случае полипептидов, синтез олигонуклеотидов может быть осуществлен ступенчатым удлинением цепн, ковалентно привязанной одним из концов (5 илн 3 ) к полимерному носителю. Синтез олигонуклеотидов на полимере начал развиваться в 60-х годах усилиями ряда групп Ф. Крамера (ФРГ) и Г. Кораны с сотр. (США), 3. А. Шаба-ровой, М. А. Прокофьева с сотр. (СССР). Такой подход принципиально более эффективен, чем синтез в растворе, так как существенно облегчается отделение продукта от исходных веществ, что приводит к сокращению времени синтеза. Кроме того, все операции легко могут быть автоматизированы (первые автоматические системы были предложены М. Гайтом и М. Карузерсом). Принципиальная схема синтеза на полимерном носителе выглядит следующим образом [c.365]

Стандартность операций в твердофазном синтезе олигонуклеотидов явилась основой для автоматизации процесса. Принцип работы автомата-синтезатора основан на подаче в реактор с помощью насоса (под контролем микропроцессора) защищенных нуклеотидных компонентов реагентов и р-рителей по заданной программе в колонку, содержащую полимерный носитель с закрепленным на нем первым нуклеозидом. После окончания синтеза и отделения полностью защищенного олигонуклеотида от полимерного носителя проводят деблокирование, очистку и анализ синтезир. фрагментов ДНК. Так, с помощью гидрофосфорильного метода [c.300]

Аналогичный прием — использование в качестве нуклеозидного компонента олигонуклеотида и наращивание полимерной цепи с З -конца — был использован и при синтезе олигонуклеотидов на полимерном носителе В этом случае был успешно реализован и другой вариант — наращивание полимерной цепи с 5 -конца с ис- [c.90]

После завершения синтеза олигонуклеотид в полностью защищенной форме связан с полимерным носителем. На рис. 5-6, А и Б показано, как следует соответственно отщепить защитные группы и снять олигонуклеотидную цепь с носителя. [c.93]

Использование синтетических олигонуклеотидов. Другой методический подход, применяемый для определения места расщепления рестриктаз, стал доступен благодаря созданию эффективных методов химического синтеза олигодезоксрибонуклеотидов. Основной прогресс в этой области был связан с разработкой более совершенного фосфотриэфирно-го [256] и фосфоамидитного методов [175] и перехода от синтеза в растворе на синтез с использованием полимерных носителей [71, 175]. [c.179]

Группа Летсингера и Клотца разработала недавно метод синтеза иеитидов с использованием матриц этот метод напоминает природный механизм синтеза на рибосомах (рис. 2.1). В методе используются полимерный носитель и полинуклеотидная матрица, но отсутствует необходимость, как и в природных системах, временно защищать аминокислоты для образования правильных связей. Такой подход назван методом комплементарного носителя (рис. 2.5). Растущая полипептидная цепь связана концевой карбоксильной группой с 5 -ОН-группой олигонуклеотида эфирной связью. Новая поступающая аминокислота также присоединена эфирной связью, но с З -ОН-групной второго олигонуклеотида. [c.65]

Попытки разработать аналогичные методики для синтеза олигосахаридов [54] и олигонуклеотидов [55] оказались не столь успешными (см. гл. 22.4). Однако синтез этих соединений вообще более труден, чем синтез пептидов, отчасти потому, что здесь приходится оперировать с большим числом защитных групп, а отчасти потому, что соединение моносахаридных звеньев может привести к смеси эггимеров. Совершенно очевидно, что для успеха в этой области необходимы более подходящие полимерные носители. [c.325]

Защита ОН-групп [Ц. Реагент взаимодействует с ОН-группами в присутствии дициклогексилкарбодиимида, давая [5-бензоилпро-пионильные производные. Снятие защиты производится при комнатной температуре обработкой гидразингидратом в пиридине с добавлением уксусной кислоты в качестве буфера. Расщепление инициируется кетогруппой, которая избирательно реагирует с гидразином. Применение смеси пиридин — уксусная кислота удобно, так как при этом не затрагиваются чувствительная к кислотам метокситри-тильная и чувствительная к основаниям цианэтилфосфатная защитные группы, а также остается без изменения пиримидиновый цикл дезоксицитидина и тимина. Эта защитная группа использовалась в синтезе олигонуклеотидов кроме того, найдено, что она удобна в синтезах на нерастворимых полимерных носителях. [c.32]

Синтезы олигонуклеотидов с использованием фосфатного и фосфитного фосфотриэфирных методов приведены на рисунках 203 и 204. На первой стадии нуклеозид присоединяют с помощью якорной группы к полимерному носителю. Затем его 5 гидроксильную группу деблокируют кислотной обработкой и конденсируют с нук леотидным компонентом. У образующегося полностью защищенного динуклеозидмонофосфата удаляют диметокситритильную группу и присоединяют следующий нуклеотид и т. д. На последней стадии продукт отщепляют от полимерного носителя, снимают защитные группы н очиш,а1от хроматографией или электрофорезом в полиакриламидном геле. [c.366]

Фосфотриэфирныи и фосфитный методы дают высокие выходы на каждых стадиях синтеза и с успехом используются для синтеза олигонуклеотидов иа полимерных носителях. [c.366]

В случае реакции 1 энзим или катализатор ковалентно связан с полимером. Хорошо известно, что ионообменные полимеры с кислотными группами широко используют в качестве гетерогенных катализаторов. В качестве примеров можно привести кислотно-каталитические реакции фенола с ацетоном с образованием 4,4 -ди-гидроксидифенил-2,2 -пропана (бисфенола А) или алкилирование фенола олефинами. В реакциях типа 2 происходит взаимодействие низкомолекулярного соединения с полимером, содержащим функциональные группы, с переходом функциональной группы или электронов (редокс-полимеры). В случае твердофазного синтеза по Мерифилду [5, 6] имеет место ступенчатое образование поли-пептидных последовательностей с помощью реакционноспособных полимерных носителей. В конце реакции основная полимерная цепь разрывается. В случае длинных полипептидных цепей вследствие неколичественного взаимодействия/ возникает разнозвенность, которая приводит к необходимости искать другие пути синтеза с применением защитных групп. Развивается направление, связанное с использованием растворимых носителей [7]. Метод Мерифилда применяют ограниченно. В последние годы, правда, твердофазный синтез снова приобрел значение для получения олигонуклеотидов, так как он включает небольшое число стадий [8]. В качестве полимерных носителей используют наряду с кремниевым гелем полистирол [9—11] и гидрофильные набухающие полимеры [12, 13]. [c.79]

С разработкой триэфирного метода трудоемкость получения искусственных олигонуклеотидов значительно снизилась, и синтез олигомера постепенно превратился из экстраординарного в тривиальное событие. Принципиальное значение имели также появление технологии синтеза на полимерном носителе, заимствованной из химии пептидов и белков, и автоматизация процесса. Благодаря этому стало возможным почти целиком доверить получение олигонуклеотидов автоматическому синтезатору ДНК. Триэфирный метод позволил получать более длинные олигомеры (15-20 нуклеотидных звеньев), что привело к повышению стабильности комплексов из-за большего перекрывания олигонуклеотидов и дало возможность получать дуплексы-интермедиаты из большего числа олигомеров. Все это способствовало созданию значительно более протяженных генов при использовании прежней методологии. [c.64]

Произошедшее изменение химии синтеза вместе с сопровождавшим его процессом автоматизации и использованием полимерных носителей в виде твердой фазы довершили начатое дело и привели к егце более широкому вовлечению олигонуклеотидов в молекулярно-биологические эксперименты. Здесь можно усмотреть некую аналогию природных процессов с только зарождавшимся в самом начале 60-х годов в ходе расшифровки генетического кода олигонуклеотидным синтезом и уже нынешним состоянием дел в этой области. И если мысленно егце раз вернуться к нашей пребиотической планете, то становится очевидным резкий скачок, который мог произойти при осугцествлении синтеза на тогдашних природных твердых фазах, потребовавший, однако, предварительной наработки мономеров для повышения их обгцей концентрации, необходимой для обеспечения эффективной полимеризации. Можно также предполагать, что с накоплением исходных мономеров, и затем полинуклеотидных молекул подобные процессы, вероятно, заметно ускорились, а с появлением у первых полимеров первичных каталитических свойств они стали идти во много раз быстрее. Так, в качестве примера практически несопоставимого по [c.12]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология