Метод комплементарной ДНК

Важнейший метод получения рекомбинантных ДНК основан на способности нуклеиновых кислот быстро восстанавливать свою структуру после нагревания до 100 °С в сильно щелочной среде (pH 13). При нагревании до 100 С комплементарные пары оснований разрушаются и ДНК диссоциирует на две раздельные цепи. Этот процесс назван денатурацией ДНК ( плавлением ). Выдерживание комплементарных цепей при температуре 65 °С приводит [c.109]

Полная денатурация молекулы ДНК приводит к расхождению комплементарных цепей. При быстром охлаждении раствора денатурированной ДНК цепи остаются в разделенном состоянии. Однако, если в течение какого-то времени поддерживать температуру чуть ниже значения Тпл (этот процесс называют отжигом), может вновь восстановиться нативная структура. Этот факт дает в руки ученым очень важный метод [c.142]

Методы, развитые Кораиой, позволили решить проблему синтеза гена. Корана провел химический синтез последовательности дезоксинуклеотидов, комплементарной к известной последовательности рибонуклеотидов в Ала-тРНК Дрожжей [lit]. [c.587]

ДНК-полимеразной реакции (рассуатриваемой в гл. II при обсуждении репликации ДНК). Принцип метода показан иа рис. 7. Как и при секвенировании ДНК по Максаму — Гилберту, здесь добиваются, чтобы обрыв цепи (при попадании на ее З -конец комплементарного терминаторного нуклеотидного остатка) происходил равновероятно по всем положениям данного остатка (рис. 7 — остаток Т). Это достигается экспериментальным выбором правиль ного соотношения дезоксинуклеозидтрифосфатов и терминаторного [c.18]

Синтез генов с помощью ПЦР Получение генов с помощью ПЦР - гораздо более быстрый и экономичный метод, чем тот, который основан на отжиге олигонуклеотидов с перекрывающимися концами, заполнении брешей с помощью ДНК-полимеразы и сшивании разрывов ДНК-лигазой. В одной из методик конструирование гена начинается с отжига двух перекрывающихся олигонуклеотидов (А и В), отвечающих центральной части гена (рис. 5.24). После отжига образуется дуплекс с заглубленными 3"-гидроксильными группами, служащими точками инициации синтеза комплементарных цепей при ПЦР. Затем в реакционную смесь добавляют еще два олигонуклеотида, С и [c.102]

При изучении стабильности спиральных структур оказалось, что носитель длиной в 8 нуклеотидов достаточен для правильного связывания с более длинной олигонуклеотидной матрицей благодаря образованию уотсон-криковских комплементарных пар (разд. 3.2.2). Использование современных химических методов образования пептидной связи позволяет удлинить полипептидную [c.66]

Весьма важное место принадлежит аффинной хроматографии [116, 117]. Она основана на использовании особых адсорбентов, специфически взаимодействующих с макромолекулами и избирательно удерживающих данный вид макромолекул (отсюда и название метода). Примером, о котором уже говорилось в разд. Г.10, служит адсорбция комплементарных фрагментов молекулы нуклеиновой кислоты на иммобилизованной ДНК. Аффинная хроматография используется также для очистки ферментов, антител и других белков, способных прочно связываться со специфическими малыми молекулами. [c.161]

Основные положения предложенной мною конформационной теории белков были сформулированы в общем виде и имели вначале чисто эвристический характер [40, 41]. Создание расчетного метода требовало их детализации и тщательной проверки. Достоинство теории даже в ее первоначальной, быть мо жет, несовершенной форме заключалось в том, что она позволяла всю необходимую работу с первой и до завершающей стадии заранее представить в виде строго последовательного ряда логически связанных между собой шагов, где каждое продвижение вперед опиралось на результаты предшествующих исследований и предваряло последующее. Иными словами, теория, отражавшая вначале чисто субъективное представление автора о структурной организации белка, в то же время представляла собой достаточно четко ориентированную рабочую программу исследования. Одно из положений теории, а именно предположение о согласованности в белковой глобуле всех внутри- и межостаточных взаимодействий, давало возможность разделить задачу на три большие взаимосвязанные части. Цель первой заключалась в кон-формационном анализе свободных остатков стандартных аминокислот, т.е. в оценке ближних взаимодействий валентно-несвязанных атомов. Идеальными моделями для изучения ближних взаимодействий явились молекулы метиламидов М-ацетил-а-аминокислот (СНз-СОМН-С НК-СОЫН-СНз). Вторая часть общей задачи состояла в выяснении влияния средних взаимодействий, т.е. взаимодействий между соседними по цепи остатками. Объектами исследования здесь могли служить любые природные олигопептиды. Цель третьей, завершающей части - изучение роли контактов между удаленными по цепи, но пространственно сближенными в глобуле остатками и априорный расчет трехмерной структуры белка. В дефинициях нелинейной неравновесной термодинамики эти цели могут быть сформулированы следующим образом. Во-первых, определение возможных конформационных флуктуаций у свободных аминокислотных остатков и выявление энергетически наиболее предпочтительных. Во-вторых, нахождение возможных конформационных флуктуаций локальных участков полипептидной цепи и установление среди них бифуркационных флуктуаций, ведущих к структурированию фрагментов за счет средних невалентных взаимодействий. В-третьих, анализ возможных флуктуаций лабильных по средним взаимодействиям участков полипептидной цепи и идентификация бифуркационных флуктуаций, обусловливающих комплементарные взаимодействия конформационно жестких нуклеаций, стабилизацию лабильных участков и, в конечном счете, образование нативной трехмерной структуры молекулы белка. [c.109]

Возможность применения рентгеноструктурного анализа для определения последовательности аминокислот в белковой молекуле была рассмотрена ранее. Следует отметить совершенно новый подход к решению этой важной проблемы - определение последовательности аминокислот в белковой молекуле с использованием данных о комплементарной нуклеотидной последовательности ДНК. Этому способствуют как методы быстрого секвенирования ДНК, так и техника изолирования и доступности самого гена . [c.56]

Указанными методами обнаруживаются двуспиральные участки в молекулах РНК, в которых нет комплементарных цепей и дая которых не соблюдается правило Чаргаффа. Двуспиральные [c.228]

Рис. 5.17. Секвенирование ДНК методом праймер-опосредованной прогулки. 1. Инициация синтеза цепи ДНК с помощью праймера (Р1), комплементарного участку плазмиды, находящемуся вблизи вставки.

Идентификация модифицированных нуклеотидных остатков в полинуклеотидной цепи РНК долгое время была задачей особой трудности. С появлением современных методов секвенирования нуклеиновых кислот она существенно упростилась. Модификацию РНК или ее расщепление ферментами ведут таким образом, чтобы (как и при секвенировании) было затронуто в среднем только одно звено на молекулу (в чем есть дополнительный смысл, так как множественная модификация РНК искажает ее структуру). Далее, если изучается РНК небольшого размера или сегмент РНК, примыкающий к одному из ее концов, то этот конец метят радиоактивной меткой и задача идентификации модифицированного основания (после расщепления соответствующего звена) или атакованной нуклеазой межнуклеотидной связи сводится, как и при секвенировании, к определению длины фрагмента по его подвижности в высокоразрешающем электрофорезе в геле. В том случае, когда анализируемый район удален от концов молекулы на расстояние больше 150—200 н. о., используют реакцию обратной транскрипции (см. гл. 13). Для этого синтезируют олигонуклеотид, комплементарный участку РНК, расположенному вблизи от анализируемого района с З -концевой стороны молекулы, и далее используют его как праймер для обратной траискриптазы. Так как этот фермент останавливается на модифицйрованных остатках матрицы (или в том месте, где расщеплена фосфодиэфирная связь), то вновь по длине образующегося фрагмента можно определить положение модифицированного звена в РНК. [c.40]

Группа Летсингера и Клотца разработала недавно метод синтеза иеитидов с использованием матриц этот метод напоминает природный механизм синтеза на рибосомах (рис. 2.1). В методе используются полимерный носитель и полинуклеотидная матрица, но отсутствует необходимость, как и в природных системах, временно защищать аминокислоты для образования правильных связей. Такой подход назван методом комплементарного носителя (рис. 2.5). Растущая полипептидная цепь связана концевой карбоксильной группой с 5 -ОН-группой олигонуклеотида эфирной связью. Новая поступающая аминокислота также присоединена эфирной связью, но с З -ОН-групной второго олигонуклеотида. [c.65]

ДНК-зонды применяют для поиска родственных генов в реакциях гибридизацрш с РНК — для выявления экспрессии данного гена в различных клетках. Для вьывления молекул нуклеиновых кислот, комплементарных всему зонду (или его участку), ДНК-зонды часто сочетают с методом гель-электрофореза, что позволяет получать информацию о размерах гибридизируемых молекул ДНК. Эффективное использование современных приборов, способных автоматически синтезировать любые нуклеотидные последовательности за короткий промежуток времени, дало возможность перестраивать гены, что представляет собой один из важных аспектов генной инженерии. Обмен генами, а также введение в клетку гена другого вида организма осуществляют посредством генетической рекомбинации in vitro. Этот подход был разработан на бактериях, в частности на Е. соИ. Он основан на важном свойстве ДНК — способности к перестройкам, изменяющим комбинацию генов в геноме и их экспрессию. Такая уникальная способность ДНК позволяет приспосабливаться данному виду к изменяющейся среде. Генетическую рекомбинацию подразделяют на два больших класса общую рекомбинацию и сайт-специфическую рекомбинацию. В процессе общей рекомбинации генетический обмен в ДНК происходит между гомологичными нуклеотидными последовательностями, например между двумя копиями одной и той же хромосомы в процессе мейоза (кроссинговера), или при скрещивании и перегруппировке генов у бактерий. [c.112]

Известен ряд методов восстановления группы С = 0 альдегидов и кетонов до группы СНа [427]. Два наиболее важных из них — это восстановление по Клемменсену и реакция Киж-нера — Вольфа. Реакция Клемменсена заключается в нагревании альдегида или кетона с амальгамой цинка в водной НС1 [428]. По этой реакции чаще восстанавливают кетоны, чем альдегиды. При восстановлении по Кижнеру — Вольфу [429] альдегид или кетон нагревают с гидразингидратом и основанием (обычно NaOH или КОН). Оригинальная методика практически полностью вытеснена модификацией Хуанг-Минлона [430] реакции Кижнера — Вольфа, согласно которой взаимодействие проводят в кипящем диэтиленгликоле. Реакцию можно вести и в более мягких условиях (при комнатной температуре) в диметилсульфоксиде при использовании в качестве основания грет-бутилата калия [431]. Реакция Кижнера — Вольфа применима также к семикарбазонам альдегидов и кетонов. Восстановление по Клемменсену на практике легче, но оно оказывается непригодным для высокомолекулярных и чувствительных к действию кислот субстратов. В этих случаях весьма полезна методика Кижнера — Вольфа. Для высокомолекулярных субстратов успешно применяется модифицированная методика Клемменсена, в которой используются активированный цинк и газообразный НС1 в таком органическом растворителе, как эфир или уксусный ангидрид [432]. Реакции Клемменсена и Кижнера — Вольфа комплементарны, поскольку в первой используется кислая среда, а во второй — щелочная. [c.313]

Как MALDI, так и ионизацию электрораспылением можно легко сочетать с ферментативным расщеплением белков для последующего определения их параметров. После расщепления белка полученная смесь целиком помещается в MALDI-спектрометр и анализируется. В наиболее благоприятных случаях можно определить массу более чем 90% пептидных фрагментов. Этот подход можно использовать для определения изменений в белке, например при определении параметров рекомбинантных белков или для идентификации ковалентно-связанных модификаторов белка. Масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением, вследствие того, что она легко сочетается как с ЖХ-МС, так и тандемной масс-спектрометрией, может быть источником еще и дополнительной информации о последовательности аминокислот в белке. При химической ионизации пептид фрагментируется на два комплементарных ряда ионов, которые имеют последовательности аминокислот, начиная с С- и N-терминальных атомов пептида. Тандемная масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением оказывается более экспрессной и находит более разнообразное применение, чем традиционные биохимические методы, такие, как последовательное отщепление аминокислот по методу Эдмана. [c.308]

Очистка и фракционирование длинных олигонуклеотидов (до 17 остатков) методом ионообменной ЖХВД требует принятия мер, предотвращающих образование локальных вторичных структур за счет комплементарных участков. Для этой цели было предложено вести элюцию с колонки Partisil 10-SAX линейным градиентом концентрации фосфатного буфера (О—0,3 М), pH 6, в 30%-ном (а в некоторых случаях 60%-ном) растворе формамида при комнатной температуре [Newton et al., 1983]. [c.322]

Большое количество полученных в последние годы экспериментальных данных свидетельствует в пользу гетерогенности рецепторов АТ II, и в дальнейшем изложении будем исходить именно из этого предположения [379-382]. Полифункциональность АТ II и гетерогенность его рецепторов можно связать с молекулярной структурной организацией гормона, изученной теоретически. Его предрасположенность к реализации ряда функций проявляется в существовании в нативных условиях нескольких близких по энергии и легко переходящих друг в друга пространственных форм. Высокая эффективность и строгая избирательность взаимодействий АТ II с различными рецепторами связаны с тем, что каждая его функция реализуется посредством актуальной только для данного рецептора конформации из состава самых предпочтительных структур свободной молекулы. Таким образом, поиск структурно-функциональной организации АТ II сводится к выяснению для каждой биологической активности пептида актуальной конформации. Для решения задачи в условиях отсутствия необходимых данных о потенциальных поверхностях мест связывания требуется использование дополнительной информации. В качестве такой информации, как правило, привлекаются данные по биологической активности синтетических аналогов природных пептидов. Однако при формировании серии аналогов без предварительного изучения конформационных возможностей как природного пептида, так и его искусственных аналогов в ходе исследования по существу случайным образом ищется прямая зависимость между отдельными остатками аминокислотной последовательности гормона и его функциями. Поскольку стимулированные гормоном аллостери-ческие эффекты возникают в результате не точечных, а множественных контактов между комплементарными друг другу потенциальными поверхностями лиганда и рецептора (иначе отсутствовала бы избирательность гормональных действий), нарушение функции при замене даже одного остатка может быть следствием ряда причин. К ним относятся исчезновение нужной функциональной группы, потеря необходимых динамических свойств актуальной конформации, запрещение последней из-за возникающих при замене остатков стерических напряжений, смещение конформационного равновесия из-за изменившихся условий взаимодействия с окружением и т.д. Следовательно, случайная замена отдельных остатков не приводит к решению задачи структурно-функциональной организации гормонов. Об этом свидетельствует отсутствие в течение нескольких десятков лет заметного прогресса в ведущихся с привлечением множества синтетических аналогов исследованиях зависимости между структурой и функцией АТ II, энкефалинов и эндорфинов, брадикининпотенцирующих пептидов, а также ряда других. Отсюда следует неизбежный вывод о необходимости привлечения к изучению структурно-функциональных отношений у пептидных гормонов специального подхода, который позволил бы отойти от метода проб и ошибок и при поиске синтетических аналогов делать сознательный выбор для их синтеза и биологических испытаний. [c.567]

Олигонуклеотид-направленный мутагенез с использованием ПЦР-амплификации Более простой и быстрый метод получения больших количеств мутантных генов, альтернативный системе с использованием фага М13, -сайт-специфический мутагенез в сочетании с полимеразной цепной реакцией (ПЦР). Один из вариантов этого подхода состоит в следующем. Ген-мишень встраивают в плазмидный вектор (рис. 8.4) и помещают препарат в две пробирки. В каждую из них добавляют по два специфических праймера для ПЦР 1 и 2 в одну пробирку, 3 и 4 - в другую. Праймеры 2 и 3 полностью комплементарны одному из участков клонированного гена или прилегающей к нему последовательности, а 1 и 3 комплементарны другому участку, но содержат один некомплементарный нуклеотид и гибридизуются с разными цепями, так что в результате происходит замена обоих нуклеотидов данной пары. Положение сайтов гибридизации праймеров 1 и 2 в одной пробирке и 3 и 4 - в другой таково, что ПЦР-продукты в разных пробирках имеют разные концы. По окончании ПЦР содержимое пробирок объединяют и проводят денатурацию, а затем ренатура-цию. Поскольку концы амплифицированных молекул ДНК из двух пробирок неодинаковы, одноцепочечные ДНК из разных пробирок ассоциируют с образованием кольцевьгх молекул с [c.163]

Как уже упоминалось, ПК в качестве лигандов могут обладать как групповой специфичностью (для белков хроматина, факторов управления трансляцией, нуклеаз и др.), так и индивидуальной (для индивидуальных мРНК, белков-регуляторов транскрипции и др.). Во втором случае на аффинном сорбенте должны быть закреплены вполне определенные участки генома. Это стало возмолшым после создания способов отбора и наработки в достаточных количествах строго идентичных фрагментов ДНК методами генной инженерии. В последнее время возникла еще одна область использования иммобилизованных НК — в качестве праймеров матричного синтеза. Эти приложения предъявляют разные требования к характеру фиксации НК на матрице. В первом случае расположение точек закрепления на молекуле НК может быть произвольным, во втором определенные и достаточно протяженные участки полинуклеотидной цепи должны быть свободны для комплементарного взаимодействия, а в третьем закрепление НК на матрице желательно осуществить лишь по одному определенному концу молекулы. Что же касается возможности реакций с активированными матрицами, то вдоль всей молекулы НК во множестве располагаются химически эквивалентные группы аминогруппы нуклеиновых оснований, гидроксилы сахаров и др. В особом положении находится только концевой остаток фосфорной кислоты или сахара. [c.387]

Принцип метода иллюстрирует рис. 148. Фрагмент ДНК, по которому ведется отбор, например содержащий определенный ген, встраивают и размножают в плазмиде. Очищенные плазмиды дробят ультразвуком или линеаризируют действием рестриктаз, а затем меркурируют, как описано выше. Фрагментированные ДНК или РНК, из которых надлежит отобрать комплементарные участки, гибридизуют с ДНК меркурированных плазмид в условиях, когда последняя находится в избытке. Гибридные молекулы (вместе с молекулами ренатурпрованной плазмидной ДНК) вносят на колонку SH-сефарозы. При этом нити плазмидной ДНК через атомы ртути ковалентно связываются с сорбентом (на рис. 148 для ясности он изображен в виде ааштрихованных полосок у стенок колонки, тогда как в действительности он заполняет весь ее объем). Промывка колонки удаляет из нее не вошедшие в состав гибридов, т. е. пе комплементарные к плазмидной ДНК фрагменты нуклеиновых кислот. Затем следует элюция 97 %-ным формамидом нри повышенной темнературе. Двунитевые структуры диссоциируют, и очищенные комплементарные участки ДНК или РНК, не будучи связанными с матрицей, выходят из колонки. Остающуюся в колонке меркурированную плазмидную ДНК можно снять, как обычно, элюцией -меркаито-этанолом. [c.438]

Первичная структура рибосомной 23S РНК Е. соИ также была установлена как ее прямым химико-энзиматическим анализом, так и путем секвенирования ДНК ее клонированного гена (рис. 44). Одновременно и некоторое время спустя были секвенированы также высокополй-мерные РНК большой рибосомной субчастицы ряда других организмов, а также хлоропластов и митохондрий, которые дали материал Для сравнительно-эволюционного анализа. Весь арсенал методов, примененный в случае 16S РНК, был использован для изучения вторичной структуры 23 S РНК, и были найдены принципиально те же закономерности и особенности. Схема модели вторичной структуры 23S РНК Е. соН дана на рис. 45. Как и в 16S РНК, около половины или более остатков цепи 23S РНК оказываются вовлеченными в двойные спирали. Всего можно насчитать несколько более 100 индивидуальных спиралей. Наиболее ярким отличием от 16S РНК является, по-видимому, комплементарное спаривание 5 -конца 23S РНК с ее З -концом довольно стабильная совершенная двойная спираль из 8 пар нуклеотидов удерживает оба конца вместе, в значительной мере фиксируя общую свернутость цепи в конечную компактную структуру. Как и в 16S РНК, пары G U не редкость в спиралях 23S РНК. Кроме того, в спиралях имеются пары G А и, [c.77]

Какие еще белки кроме гистонов обнаруживаются в клеточных ядрах Методом электрофореза в полиакриламидном геле было установлено, что в ядрах клеток НеЬа содержится около 450 компонентов, большинство из которых присутствует в небольших количествах (<10 000 молекул в расчете на одну клетку) и не обнаруживается в цитоплазме [302]. К наиболее кислым белкам относится большое число ферментов, включая РНК-полимфазу. Кроме того, в ядрах содержатся 1) определенные репрессоры генов, в основном не идентифицированные, 2) бел ки, связывающие гормоны, и 3) многие другие белки [303]. Наряду с ядерными белками, которым уделяется обычно основное внимание, определенную роль в регуляции фенотипического выражения генов играет также мало исследованный класс небольших ядерных РНК. Молекулы этой РНК длиной от 65 до 200 нуклеотидов могут стимулировать транскрипцию специфических генов, связываясь с комплементарными участками ДНК. Таким образом, информация, транскрибированная с одного участка хромосомы, может оказывать влияние на процессы, протекающие на другом участке или на другой хромосоме [303а]. [c.304]

В молекулярной биологии широко используется способность денатурированных ДНК ренатурировать с восстановлением исходной двуспиральной структуры. Она лежит в основе метода молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот, который позволяет выявлять степень сходства различных ДНК (а также РНК). Для этого денатурированную ДНК (если изучается гибридизация двух различных нуклеиновых кислот, то одна из них несет радиоактивную метку) помещают в условия, оптимальные для образования двойных спиралей (ионная сила раствора — около 0,2 температу за — на 10—20 "С ниже Тт нативной ДНК). В случае полностью комплементарных цепей ДНК со временем они целиком превратятся в двуспиральные молекулы. Если в смеси присутствуют как комплементарные, так и некомплементарные цепи ДНК, то после ренатурации первых тем или иным способом определяют долю двуспиральных молекул. В настоящее время широко распространены методы, когда денатурированные молекулы ДНК одного типа закрепляются на нитроцеллюлозных фильтрах, которые затем помещают в раствор ДНК (или РНК) другого типа. После образования двуспиральных комплексов на фильтрах они легко могут быть отмыты от несвязав-шейся ДНК- Этот же подход используется при выявлении цепей ДНК (или РНК), комплементарных другим ДНК (или РНК), после разделения их электрофорезом в гелях. [c.30]

Ауксотрофы по пита- Комплементарность тельным веществам Метод реплик Супрессорные гены [c.308]

Совр. методы хим. синтеза Н.к. позволяют получать крупные фрагменты ДНК, в т.ч. целые гены. Методич. основы хим.-ферментативных методов синтеза ДНК разработаны X. Кораной. Они включают 1) хим. сиитез комплементарных, взаимоперекрывающихся олигонуклеотидов, из к-рых затем в результате комплементационных взаимод. выстраиваются дуплексы-фрагменты молекулы синтезируемой ДНК с несовпадающими разрывами в обеих цепях 2) соединение (лигирование) таких олигонуклеотидов в составе дуплекса с помощью фермента Т4 ДНК-лигазы. Сборку протяженных ДНК из синтетнч. однотяжевых олигонуклеотидов проводят в неск. этапов (рис. 4). Сначала (а) [c.299]

Одним из типов двойных спиралей, которые получают искусственным путем, является гибрид ДНК—РНК. Оказалось, что молекулы информационной (матричной) РНК (мРНК) гибридизуются только с одной из двух разделившихся цепей ДНК, несущей участки, комплементарные мРНК. Метод гибридизации используется также для получения гетеродуплексов ДНК, в которых две цепи молекулы происходят от двух разных генетических линий одного и того же вида организмов. Известно, что некоторые мутации состоят в делеции (выпадении) или вставке одного или нескольких оснований в цепь ДНК. Гетеродуплексы, в которых одна из цепей нативная, а другая — со вставкой или делеци-ей, имеют по всей своей длине нормальную структуру по Уотсону—Крику, за исключением тех участков, где делеции или вставки нарушают комплементарность и образуются одноцепочечные петли (рис. 15-24). [c.143]

В исследовании взаимодействий полифункциональных гормонов и рецепторов с привлечением синтетических аналогов не исключены ситуации (они не предсказуемы, поскольку выбор аналогов, как правило, случаен), когда наиболее предпочтительная конформация синтетического пептида стерически комплементарна активному центру рецептора, но необходимый комплекс тем не менее не образуется, так как модифицированная последовательность не содержит остатков, необходимых для образования эффективных контактов с функциональными группами рецептора. Возможен, конечно, и прямо противоположный случай, приводящий к тому же результату. Принципиально слабым местом в используемом в настоящее время подходе к установлению зависимости между структурой и функцией пептидов и, в частности, гормонов является то, что он базируется на случайном поиске синтетических аналогов методом проб и ошибок Поэтому, отдавая должное усилиям в экспериментальном и теоретическом изучении искусственно модифицированных последовательностей энкефалинов, следует сказать, что при существующем интуитивном выборе модельных соединений можно рассчитывать лишь на частный успех. Качественный прогресс здесь можно ожидать только при строго научном, а не случайном подборе аналогов, иными словами, при отходе от метода проб и ошибок к методу, обладающему предсказательными возможностями и доказательной силой. Первая попытка в этом направлении [28, 29] основывается на решении обратной структурной задачи, т.е. на сознательном, целенаправленном конструировании химического строения немногочисленных искусственных аналогов, пространственное строение которых в своей совокупности отвечает набору низкоэнергетических, физиологических активных состояний природного гормона (см. гл. 17). Детально структурнофункциональная организация природных пептидов будет обсуждена в следующем томе издания "Проблема белка". О первых успехах рентгеноструктурного анализа в изучении трехмерных структур рецепторов рассказывается во втором томе издания [98. Гл. 3, 4]. [c.353]

Молекулярная биология занимает -особое место в развитии науки второй половины XX в. Именно ее рождение и последующий бурный рост выдвинули биологию в целом в ряды самых передовых и популярных наук, а XX в. стали иногда называть веком биологии . Возникнув как отрасль биохимии, молекулярная биология получила мощное развитие благодаря внедрению в нее вдей и методов генетики и физики. Открытый и сформулированный в 1953 г. принцип комплементарности в нуклеиновых кислотах, объяснив особенности структуры этих макромолекуляр-ных соединений и обладая предсказательной силой в отношении их функций, лег в основу нового направления науки. Огромное научное и методологическое значение молекулярной биологии состояло в том, что наиболее фундаментальное и таинственное свойство живой материи — воспроизведение себе подобного — оказалось возможным объяснить на молекулярном уровне. Молекулярная структура вещества, в котором записана (закодирована) генетическая информация, механизмы воспроизведения генетической информации в поколениях клеток и организмов и механизмы реализации генетической информации через биосинтез белков —вот три направления, по которым развивалась эта наука и где были сделаны решающие успехи. Кроме того, структура и механизмы функционирования белков стали также предметом молекулярной биологии. [c.3]

К настоящему времени субъединичная структура обнаружена у нескольких сотен белков. Однако только для немногих белков, в том числе для молекулы гемоглобина, методом рентгеноструктурного анализа расшифрована четвертичная структура . Основными силами, стабилизирующими четвертичную структуру, являются нековалентные связи между контактными площадками протомеров, которые взаимодействуют друг с другом по типу комплементарности—универсальному принципу, свойственному живой природе. Структура белка после его синтеза в рибосоме может частично подвергаться модификации (посттрансляционный процессгшг) например, при превращении предшественников ряда ферментов или гормонов (инсулин). [c.71]

Меченые ДНК-зонды можно получить разными способами. Один из них, называемый методом случайных праймеров, основан на применении смеси синтетических олигонуклеотидов (олигомеров), содержащих все возможные комбинации из шести нуклеотидов. Некоторые из этих олигонуклеотидов оказываются комплементарными последовательностям ДНК-мище- [c.65]

Рис. 4.12. Получение меченого ДНК-зонда методом случайных праймеров. К денатурированной двухцепочечной ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, которую предполагается использовать в качестве зонда, добавляют гексануклеотиды (смесь всех возможных комбинаций из шести нуклеотидов) и отжигают смесь. Некоторые из олигонуклеотидов гибридизуются с немеченой денатурированной ДНК, и в присутствии фрагмента Кленова и четырех с1НТР (один из которых меченый [ ]) служат затравкой для синтеза комплементарной цепи. После денатурации синтезированной ДНК получают смесь меченых фрагментов ДНК, которые вместе составляют практически полноразмерную исходную ДНК-матрицу.

М 13-векторов, содержащих перекрывающиеся субклонированные последовательности, значительно увеличивается. Чтобы решить эту задачу, были разработаны методы секвенирования двухцепочечных плазмидных ДНК, не требующие субклонирования. Плазмидную ДНК, содержащую нужную вставку, вьщеляют и отжигают с синтетическим олигонуклеотидным праймером, который гибридизуется с последовательностью в одной из цепей векторной ДНК, находящейся вблизи вставки. Затем осуществляют дидезокси-секвенирование, позволяющее идентифицировать первые 250-350 нуклеотидов вставки. Исходя из этих данных синтезируют второй олигонуклеотидный праймер, комплементарный сегменту вставки, отстоящему примерно на 300 нуклеотидов от места связывания первого праймера, и секвенируют следующие 250-350 нуклеотидов. Аналогичным образом синтезируют третий праймер и определяют нуклеотидную последовательность следующих 250—350 нуклеотидов (рис. 5.17). Эту процедуру, называемую праймер-опосредованной прогулкой, продолжают до тех пор, пока не секвенируют весь фрагмент. Аналогичным образом секвенируют вторую цепь, начиная с праймера, который гибридизуется с этой цепью вблизи вставки. [c.93]

Для определения нуклеотидной последовательности протяженных клонированных сегментов сначала подбирают синтетический олигонуклеотидный праймер, комплементарный участку, соседствующему со вставкой, и с помощью диде-зокси-метода секвенируют первые 250-300 нуклеотидов. Затем по результатам секвенирования синтезируют второй праймер и определяют последовательность следующих 250-350 нуклеоти- [c.103]

Методика олигоггуклеотид-направ-ленного мутагенеза (сайт-спенифи-ческого мутагенеза) была разработана в основном в лаборатории М. Смита как модификация метода спасения маркера . При спасении маркера мутацию в фаговой ДНК устраняют с помоцгью отжига мутантной ДНК с фрагментом комплементарной ДНК дикого типа. Было показано, что, отжигая химически синтезированный олигонуклеотид с фаговой ДНК, можно, напротив. [c.165]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология