Бактериофаги как вектор при клонировании ДНК

Чтобы иметь возможность клонировать целый ген, донорную ДНК расщепляют лишь частично. При этом получаются фрагменты разной длины, из которых затем создают геномную библиотеку. Для клонирования крупных фрагментов ДНК были сконструированы векторы на основе бактериофагов X и Р1, а также плазмиды Р. [c.78]

Рис. 5.16. Использование бактериофага М13 для клонирования и секвенирования. А. Встраивание фрагмента ДНК в двухцепочечную репликативную форму ДНК М13. Б. Секвенирование комплементарных цепей клонированного фрагмента ДНК с помощью одного и того же праймера (Р1). Стрелками показана ориентация вставки в векторе.

К сожалению, в результате ошибочного спаривания праймера заданной длины с более чем одним участком внутри вставки могут быть получены неоднозначные результаты. Чтобы избежать этого, используют праймеры длиной не менее 24 нуклеотидов и стараются строго соблюдать условия отжига. Именно таким образом были секвенированы фрагменты ДНК, клонированные в бактериофаге X (-20 т. п. н.) или в космидном векторе (-40 т. п. н.). [c.93]

Клонирование при использовании в качестве векторов бактериофага А осуществляется следующим образом к суспензии бактерий, обработанных СаСЬ., добавляется ДНК фага и осуществляется посев на чашку Петри с питательным агаром так, чтобы на [c.435]

Рис. 1.8. Клонирование ДНК в векторе на основе бактериофага X,

Геном бактериофага X был превращен генными инженерами в наиболее удобный вектор для клонирования крупных фрагментов чужеродной ДНК. В геноме фага X есть два участка, не содержащие генов, необходимых для литического развития и производства потомства. Эти участки включают, соответственно, 22000 нуклеотидных пар в середине карты и 3000 между генами Р и Q (см. рис. 7.7). Таким образом, около [c.280]

Первая глава данного тома касается использования плаз-мидных векторов, имеющих в своем составе высокоспецифичные промоторы РНК-полимераз некоторых бактериофагов. Такие векторные молекулы позволяют получать радиоактивно меченные зонды, которые благодаря своим уникальным свойствам все шире применяются сейчас в исследованиях структуры и функций нуклеиновых кислот. Подобные системы на основе космидных векторов рассматриваются во второй главе. Эти векторы разработаны для того, чтобы сделать менее трудоемкими прогулки по хромосомам высших организмов. Фаговые промоторы здесь расположены таким образом, что синтезируемый радиоактивно меченный зонд соответствует концевой области клонированной ДНК, а это облегчает поиск клонов, содержащих перекрывающиеся сегменты ДНК. [c.8]

Вектор. Плазмида или бактериофаг, в которые может быть введена чужеродная ДНК с целью клонирования. [c.51]

Бактериофаги широко используют в качестве векторов для клонирования фрагментов ДНК и введения определенных генов в промышленные бактерии. [c.214]

Векторы на основе бактериофагов, содержащих одноцепочечную ДНК. Лучшие векторы такого типа разработаны на основе фага М13. В зрелую фаговую частицу входит одноцепочечная ДНК длиной 6500 нуклеотидов. После проникновения в клетку одноцепочечная ДНК фага превращается в двухцепочечную репликативную форму (РФ), которую выделяют из клеток и используют как вектор для клонирования. В инфицированной клетке накапливается 100—200 копий РФ ДНК. После этого синтез становится асимметричным и синтезируется лишь одна нить ДНК, которая входит в состав зрелого фага. Фаг М13 не убивает клетку, но лишь замедляет ее деление. Частицы зрелого фага непрерывно выделяются в среду, и их титр в культуральной жидкости может достигать 10 в 1 мл. [c.152]

Векторные системы, способные интегрировать крупные вставки (>100 т. п. н.), имеют большую ценность при анализе сложных эукариотических геномов. Без таких векторов не обойтись, например, при картировании генома человека или при идентификации отдельных генов. В отличие от библиотек с небольшими вставками, в геномной библиотеке с крупными вставками скорее всего будет представлен весь генетический материал организма. Кроме того, в этом случае уменьшается число клонов, которые нужно поддерживать, и увеличивается вероятность того, что каждый из генов будет присутствовать в своем клоне. Для клонирования фрагментов ДНК размером от 100 до 300 т. п. н. был сконструирован низкокопийный плазмидный вектор на основе бактериофага Р1 — химерная конструкция, называемая искусственной хромосомой на основе фага Р1. Был создан также очень стабильный вектор, способный интегрировать вставки длиной от 150 до 300 т. п. н., на основе Р-плазмиды (F-фактора, или фактора фертильности) Е. соИ, которая представлена в клетке одной или двумя копиями, с селекционной системой la Z векторов pU . Эта конструк- [c.76]

Амплифицированные кДНК обрабатывают специфическими рестрицирующими эндонуклеазами, а затем встраивают в вектор на основе бактериофага Х. кДНК Н- и L-цепей содержат разные, характерные для каждой из них эндонуклеазные сайты, что облегчает специфическое встраивание каждой нуклеотидной последовательности в свой вектор. На этом этапе происходит клонирование множества разных сегментов Н- и L-цепей (рис. 10.13, Ап Б). [c.218]

Рис. 10.13. Сконструированные участки ДНК из комбинаторной библиотеки кДНК Fv-фрагмента, клонированные в бактериофаг а. А и Б. Фрагменты ДНК L-( ) и Н-( ) цепей раздельно встроили в векторы на основе бактериофага а. В. Провели рестрикцию каждой iT oRI-библиотеки и лигировали фрагменты ДНК из библиотеки Н-цепи с фрагментами ДНК из библиотеки L-цепи, в результате чего получили комбинаторную библиотеку, содержащую все возможные сочетания фрагментов L- и Н-цепей с экспрессией соединенного фрагмента в одном векторе. pLa - /ас-промотор Е. соН, ССР - сайт связывания с рибосомой.

На основе бактериофага Я. были сконструированы векторы, в составе которых фрагменты чужеродной ДНК длиной до 22 т. н. п. весьма стабильны. При создании таких векторов для клонирования на основе фага А. учитывалось то обстоятельство, что вся центральная часть молекулы ДНК фага ( 19 т. н. п.) не нужна для репликации фага в Е. соИ. Эту область с помощью рестриктазы вырезают из генома фага так, что правый и левый концевые фрагменты (так называемые правое и левое плечо фага), необходимые для репликации, остаются неизменными. Плечи фага отделяют от остальных фрагментов и используют в качестве векторов для клонирования, содержащих на месте вырезанной фаговой ДНК вставку чужеродной ДНК размером около 9— 21 т. н. п. Размножаются в бактери-40 [c.40]

Описанный в гл. 19 метод клонирования чужеродных последовате ьностей в бактериофагах или плазмидах может быть использован и для встраивания генов в эукариотические вирусы. Путем внесения необходимых разрывов рестриктазами и последующего объединения полученных фрагментов глобиновый, инсулиновый и другие гены из множества источников были встроены в эукариотические вирусные векторы. Один из наиболее распространенных векторов-обезьяний вирус 8У-40, который может размножаться в клетках ряда млекопитающих. Новые гены могут быть встроены в область ранних или поздних генов транскрипционной единицы вируса. Их экспрессия включает стадию образования РНК-предше-ственника, на 5 -конце которого обычно имеются вирусные последовательности, за которыми следует последовательность встроенного гена. Такие РНК подвергаются нормальному сплайсингу, как показано на рис. 26.8. [c.325]

При специфической трансдукции фрагмент бактериальной ДНК связан ковалентно с фаговой хромосомой и реплицируется в ее составе. Это позволяет мультиплицировать трансдуцируемые бактериальные гены и манипулировать ими в лабораторных условиях. Явление специфической трансдукции было открыто при работе с умеренным бактериофагом X, развивающимся в клетках Е. соИ К-12 (Morse et al., 1956). Этот фаг является представителем большого семейства лямбдоидных фагов. Он сыграл исключрггельную роль в развитии молекулярной генетики и генетической инженерии. Столь же значительна роль нитевидных фагов семейства М13. Их ДНК широко используется в качестве векторов. Поэтому для понимания многих аспектов генно-инженерных работ необходимо знать основные элементы их генетики и биологии развития. По трем причинам более детально описан фаг Х. Во-первых, это классический объект, послуживший моделью при изучении регуляции экспрессии генов вообще и временного профаммирования развития фагов в частности. Во-вторых, в 60-е годы он явился объектом, на котором была заложена база генетической инженерии — представление о векторе и возможности клонирования и экспрессии в нем чужеродных генов. В третьих, в 70-е годы [c.103]

Выбор типа вектора—плазмидного или фагово-го-зависит от цели эксперимента, размера внедряемого фрагмента и относительного содержания нужного фрагмента в применяемой смеси фрагментов ДНК. В целом фаговьае векторы боже эффективны, чем плазмидные, при клонировании крупных вставок, и С1фининг больщого числа негативных колоний на содержание специфической вставки провести проще, чем скрининг больщого количества бактериальных колоний (гл. 6). Самьши распространенными векторами для Е. соИ являются два бактериофага— Хи М13. [c.238]

Системы с другими хозяином и вектором едва ли когда-нибудь смогут конкурировать с Е. со//-систе-мами В том, что касается вьщеления и очистки сегментов ДНК. Тем не менее возможность эффективного клонирования в других видах бактерий очень важна для изучения генетических свойств и экспрессии генов у организмов, представляющих научный, медицинский или промышленный интерес. Поэтому, несмотря на малое число хорошо охарактеризованных плазмид и бактериофагов и экспериментальные трудности при введении молекул ДНК в некоторые клетки, были разработаны полезные системы, способные служить векторами. Если отсутствовали подходяш ие для данного вида природные плазмиды или фаги, то иногда использовали плазмиды и фаги, полученные от других бактерий. Многие плазмиды и бактериофаги весьма требовательны и реплицируются только в одном или нескольких родственных видах клеток, но некоторые из них на удивление неприхотливы и репродуцируются в широком Круге хозяев, принадле-жагцих К разным видам. [c.249]

Получение одноцепочечной ДПК для секвенирования с помощью дидезокси-терминаторов. Молекулы ДНК обычно являются двух цеп очечным и исключение составляют лищь одноцепочечные ДНК некоторых бактериофагов. Как мы уже говорили, физическое разделение цепей дугшекса не всегда осуществимо (разд. 7.2.а). Для разделения цепей дуплекс денатурируют нагреванием или обработкой щелочью и проводят гель-электрофорез или хромато-фафию. Разделение двух комплементарных цепей происходит, по-видимому, благодаря различиям их конформаций, обусловленным различиями во вторичной структуре. Если разделения не произощло, применяют другие методы получения одиночных цепей. Наиболее эффективный из них состоит в клонировании фрагмента ДНК в векторе, скон- [c.326]

Смотреть страницы где упоминается термин Бактериофаги как вектор при клонировании ДНК: [c.74] [c.149] [c.159] [c.441] [c.319] [c.216] [c.319] [c.336] [c.40] [c.39] [c.40] [c.149] [c.35] [c.84] [c.76] [c.81] [c.86] [c.93] [c.39] [c.92] [c.93] [c.49] [c.158] [c.248] [c.336] [c.227] [c.249] [c.292] [c.303] [c.304]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология