Фосфодиэстераза селезенки

ВЫХ нуклеозид-З -фосфатов легко расщепляются до нуклеозид-З -фосфатов XI, а соответствующие производные нуклеозид-2 -фосфа-тов не затрагиваются ферментом. Следовательно, в РНК — природном субстрате панкреатической рибонуклеазы — также существует 3 —б -фосфодиэфирная связь Такой вывод был подтвержден далее выделением нуклеозид-З -фосфатов при расщеплении РНК под действием фосфодиэстеразы селезенки, причем при этой реакции промежуточного образования циклического фосфата XII не происходит и миграция фосфорильной группы исключена [c.43]

Гидролиз олигонуклеотида, катализируемый фосфодиэстеразой селезенки ( схема 1), начинается с левого конца цепи и протекает по направлению к правому с образованием нук- [c.98]

Частичный гидролиз фосфодиэстеразой селезенки. Целесообразность использования частичного гидролиза фосфодиэстеразой селезенки при анализе последовательности обсуждается в гл. 5. Условия проведения этой операции несколько различаются в зависимости от того, выделен ли олигонуклеотид из панкреатического, -или U2 -гидролизата главным образом вследствие того, что скорость отщепления концевых нуклеотидов при помощи фосфодиэстеразы селезенки неодинакова U>A = G > С. Поскольку в продуктах Т1 и U2-РНК-азных гидролизатов вероятность присутст- [c.280]

ВИЯ концевого С достаточно высока гидролиз соответствующих олигонуклеотидов при помощи фосфодиэстеразы селезенки следует вести более продолжительное время. Типичная реакционная смесь содержит [c.281]

Если исследуемый образец представляет собой смесь олигонуклеотидов, то интерпретация результатов частичного гидролиза усложняется, хотя в случае смеси только двух олигонуклеотидов результаты иногда все же удается интерпретировать. В др>тих случаях, прежде чем проводить частичный гидролиз фосфодиэстеразой селезенки, олигонуклеотиды необходимо разделить. [c.282]

А — олигонуклеотиды, полученные при гидролизе рибосомной РНК рибонуклеазой Т), обработаны фосфодиэстеразой селезенки. Б — некоторые олигонуклеотиды, образовавшиеся при гидролизе рибосомной РНК панкреатической рибонуклеазой, обработаны фосфодиэстеразой селезенки. Жирными линиями показано положение неизмененных нуклеотидов, которые использовались для контроля. [c.66]

Фосфодиэстераза селезенки аналогично расщепляет РНК до З -моно-нуклеотидов, однако в отличие от панкреатической РНК-азы не проявляет специфичности действия в отношении пуриновых и пиримидиновых межнуклеотидных связей . [c.386]

Фосфодиэстераза селезенки, напротив, последовательно атакует олигонуклеотиды с конца, несущего свободную 5 -гидроксильную группу, и образует нуклеозид-З -фосфаты. Концевой нуклеотид, содержащий свободные 2 - и З -гидроксильные группы, освобождается в форме нуклеозида, что дает возможность идентифицировать его и использовать для определения концевой группы [c.391]

В РНК возможна этерификация гидроксидных групп при атомах С-2, С-3 и С-5. При обработке РНК фосфодиэстеразой змеиного яда основными продуктами гидролиза являются нуклеозид-5 -фосфаты при обработке РНК фосфодиэстеразой селезенки образуются нуклеозид-З -фосфаты. Следовательно, как и в случае ДНК, межнуклеотидные связи в РНК находятся между атомами С-3 и С-5. [c.233]

В 1958 г. Хорана предложил для последовательной деструкции цоли-дезоксирибонуклеотидов использовать избирательный ферментативный гидролиз. Были найдены два специфических фермента, которые избирательно расщепляли 3 -5 -связь дизамещенного эфира по месту связи Ссз)—О или С сз)—С ("5) — О. Фосфодиэстераза селезенки расщепляла эту связь по месту С(5)—О, оставляя С (з)-фосфат, диэстераза змеиного яда — связь С (3) —О, оставляя С (5)-фосфат. Так как в полимерной цепи ДНК или соответствующего олигонуклеотида с одного края всегда находится нуклеотид со свободной С (3)-гидроксильной группой, а с другой стороны цепь заканчивается нуклеотидом со свободным С (Г)-гидроксилом, то, очевидно, можно, действуя тем или иным ферментом, последовательно разрушать цепь с одного из ее концов, идентифицируя отщепляющиеся мононуклеотиды с помощью бумажной хроматографии. [c.254]

Продукт, содержащий Р, далее гидролизуют с помощью микрокок-ковой ДНКазы и фосфодиэстеразы селезенки (табл. 2-11) и получают фрагменты, представленные в уравнении 2 30. Поскольку данные гидролитические ферменты катализируют, только разрывы Ь-типа [c.178]

Из панкреатической железы была выделена рибонуклеаза, полученная в 1940 г. в кристаллическом состоянии. Она действует на РНК, расщепляя фосфоэфирную связь присоединенного к положению 3 пиримидинового нуклеозида (см. гл. 22.3). Особенности ее действия были исследованы Маркхамом и Смитом, которые показали, что первичными продуктами действия этой РНазы на РНК являются 2, 3 -циклофосфаты уридина и цитидина (47). Они в свою очередь на следующей стадии ферментативной реакции мед ленно гидролизуются до З -фосфатов [60]. Для пуриновых остат ков в то время не было аналогичных ферментов, обладающих по добной специфичностью. (Такодиастаза была открыта позднее) Однако в руках исследователей была фосфодиэстераза селезенки которая действует как экзонуклеаза н дает все четыре рибонук леозид-З -фосфата. [c.58]

С помощью химического и ферментативного гидролиза было показано, что синтетические полинуклеотиды, как и РНК, состоят из нуклеозид-5 -монофосфатных единиц, связанных между собой 3, 5 -фосфодиэфирными связями (стр. 46). Анализ концевых групп показал, что на конце полипептидной цепи находится фосфатная группа, этерифицированная по С-5 концевого нуклеозида. При гидролизе щелочью, фосфодиэстеразой змеиного яда, фосфодиэстеразой из селезенки или панкреатической рибонуклеазой эти полимеры дают точно такие же продукты, как и РНК. Очоа и его сотрудники воспользовались перечисленными свойствами, чтобы выяснить природу межнуклеотидных связей, образуемых с помощью фермента. Они синтезировали (А, Г, У, Ц)-полимер из смеси нуклеотидов, содержавшей АДФ, меченный по фосфору, и затем гидролизовали его фосфодиэстеразой змеиного яда (фиг. 87). Из полученных после гидролиза четырех нуклеозид-5 -фосфатов меченым оказался только АМФ, и его удельная радиоактивность соответствовала удельной радиоактивности первоначально включенного АМФ. Следовательно, во время синтеза фосфоэфирпая связь АМФ не затрагивалась. Если же синтезированный полимер гидролизовали щелочью или фосфодиэстеразой селезенки, то метку включал каждый из четырех пуклеозид-З -монофосфатов. Значит, в ходе синтеза полинуклеотидфосфорилаза формирует связи А—ф—А, Ц—ф—А, У—ф—А и Г—ф—А. Аналогичные результаты были получены с Р -УДФ. [c.253]

Практически, однако, дело обстоит несколько сложнее. Расщепление полинуклеотидов с концевой фосфатной группой гладко протекает лишь при использовании химических методов деградации, при расщеплении же под действием ферментов существенным условием быстрого протекания реакции является отсутствие фосфатной группы на З -конце полинуклеотидной цепи в случае фосфодиэстеразы змеиного яда и на 5 -конце—в случае фосфодиэстеразы селезенки (см. стр. 67). По этой причине перед ферментативным расщеплением необходимо удаление концевых фосфатных групп действием фосфомоноэстеразы, что приводит к исчезновению специфического фрагмента, образующегося из фосфорилированного конца цепи. [c.46]

Фосфодиэстераза селезенки — неспецифическая экзонуклеаза, гвдролизующая РНК с образованием нуклеозид-3 -монофосфатов. Гидролиз полинуклеотидных цепей РНК фосфодиэстераза селезенки начинает с 5 -гидроксильного конца цепи. Субстратом для этого фермента могут быть также олигонуклеотиды, возникающие вследствие действия ДНК-азы II на ДНК, в результате которого образуются дезоксирибонуклео-зид-3 -фосфаты. Полинуклеотиды с б -фосфат ной концевой группой фосфодиэстеразой селезенки не гидролизуются. [c.86]

Принимая кинетические параметры близкими к наблюдаемым в оптимальных условиях, а именно к = 1,5, 2 =1,3, г 1 = 0,16 и 0-1 = 02= 1, авторы провели вычисления и построили щзивые зависимости концентрации каждого отщепившегося нуклеотида от времени действия экзонуклеазы (фосфодиэстеразы селезенки)(см. рис.. 5. 2). Далее необходимо было при помощи кинетических представлений вывести из этих данных правильную последовательность. [c.105]

Как упоминалось выше, для определения последовательности коротких олигонуклеотидов при условии Kj (E)q были успешно использованы фосфодиэстеразы селезенки и змеиного яда. В основе этого подхода лежит гот факт, чго олигонуклеотиды с данной длиной цепи, полученные при аействии экзонуклеазы, идентичны между собой. На схеме, приведенной ниже, это показано на примере частичного гидролиза гипотетического олигонуклеотида Ap pGpU под действием фосфодиэстеразы змеиного яца [c.108]

Частичный гидролиз фосфодиэстеразой селезенки также дает смесь последовательно укороченных олигонуклеотид-ных фрагментов, как видно на приводимом ниже примере гипотетического олигонуклеотида АрСрСри [c.109]

Левый концевой остаток высвобождается при этом в виде нуклеозида. Вторую порцию дефосфорилированного вещества обрабатывают фосфодиэстеразой селезенки [17—20] [c.13]

Е. соИ содержит рибонуклеазу (эндонуклеазу), поэтому использовани неочищенного фермента может привести к неправильному определению концевых групп. Из своего опыта [22] мы знаем, что фосфодиэстераза селезенки обладает некоторой эндонуклеазной активностью, что также приводит к ошибочному определению концевых остатков. Описанный выше метод достаточно надежен при анализе коротких олигомеров (до гексануклеотидов), однако его нельзя рекомендовать для длинных олигомеров, содержащих 20 и более нуклеотидных остатков. [c.14]

Фиг. 4. Схема разделения на ДЭАЭ-целлюлозе (pH 1,9) разных олигонукяеотндов после частичного гидролиза фосфодиэстеразой селезенки.

В случае ДНК теоретически возможны 3 —5 -, 3 —3 - и 5 —5 -связи, однако 3 —З -и 5 —5 -связив природной ДНК не обнаружены. При действии дезоксирибонуклеазы (ДНК-азы) ДНК распадается на ряд олигонуклеотидов, которые при обработке специфической фосфодиэстеразой змеиного яда дают исключительно дезоксинуклеозид-5 -фосфаты, а при воздействии фосфодиэстеразы селезенки, специфичной по отношению к связи между фосфором и гидроксилом у С5,, выделяют дезокси-нуклеозид-З -фосфаты . [c.385]

Для изучения нуклеотидной иоследовательности в ДНК пользуются методами ферментативною гидролиза, основанными на избирательном ферментативном расщеплении концевых связей О5 —Р (фосфодиэстераза селезенки) и межнуклеотидных связей Оз-—Р (диэстераза змеиного яда). Выбирая соответствующие ферменты, можно провести расщепление олиго-нуклеотидной цепи, начиная с того или другого конца, и получить смесь различных моно- и олигонуклеотидов. К сожалению, для ДНК неизвестны ферменты, специфичные в отношении гетероциклических оснований. [c.388]

Дезоксирибонуклеиновые кислоты являются полинуклеотидами, в которых фосфатные остатки каждого нуклеотида служат мостиками при образовании фосфодиэфирных связей между остатками дезоксирибозы. Доказательство того, что межнуклеотидные связи находятся между атомами С-3 и С-5, получено при изучении ферментативных гидролизатов ДНК. Последовательный гидролиз ДНК панкреатической дезоксирибонуклеазой (ДНазой) и фосфоди-эстеразой змеиного яда дает смесь дезоксирибонуклеозид-5 -фосфа-тов. Комбинированное действие ДНазы и фосфодиэстеразы селезенки приводит к дезоксирибонуклеозид-З -фосфатам. Таким образом, ДНК является длинноцепочечным полимером с диэфирными межнуклеотидными связями между атомами С-3 и С-5, как показано на рис. 7.1 для фрагмента цепи ДНК. [c.214]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология