Сефароза в хроматографии

Ситуация заметно ухудшается в том случае, когда связывание белкового лиганда с матрицей происходит не в одной, а в нескольких точках. Об этом уже упоминалось при анализе условий фиксации лигандов на Br N-активированной сефарозе довольно много было сказано и в предыдуп(ей главе. Тем не менее имеет смысл остановиться на этом вопросе еще раз — в аспекте аффинной хроматографии. Многоточечное связывание белка с матрицей может приводить как к недоступности активного участка белковой молекулы, так и к ее денатурации за счет растяжения, т. е. к потере биологической активности. [c.386]

Описано также фракционирование интерферона человека аффинной хроматографией на конканавалин А-сефарозе. При этом обна- [c.416]

В обычной аффинной хроматографии для иммобилизации субстратов в качестве носителей используются агароза и сшитая сефароза. В качестве сшивающего агента обычно выступает ВгСМ, а мостик образован а,о)-диамином. Эти полисахаридные носители подвержены биодеградации, и, следовательно, органические полимерные гели более удобны в качестве матрицы и допускают более широкий набор химических модификаций. Именно эти причины побудили Уайт-сайдса и сотр. разработать новый метод иммобилизации ферментов в сшитых органических полимерных гелях [126]. По своей простоте и универсальности этот метод превосходит ранее предложенные. Особенно ценен он при иммобилизации относительно лабильных ферментов для использования в ферментерах большого размера при проведении реакций органического синтеза, катализируемых ферментами. [c.257]

Рис. 138. Очистка гаптоглобина из плазмы аф- А финной хроматографией на гемоглобин-сефарозе [Delers et al., 1981] >

Если хроматографировать в водном растворе такие соединения, молекулы которых не имеют форму компактных глобул, то зависимость / av, или Ve, ОТ молекулярной массы носит аномальный характер. Это явление полностью или частично исчезает, когда хроматографию ведут в концентрированных растворах мочевины или солянокислого гуанидина. В этих условиях полипептидные цепи принимают конфигурацию статистического клубка, а следовательно, исчезают вариации Ve, связанные с формой нативной молекулы. Часто 8—9 М мочевина не дает должного эффекта, напротив, 4—6 М раствор солянокислого гуанидина вызывает полную диссоциацию полипептидных цепей. ГПХ на сефарозе 6В в 6 М растворе солянокислого гуанидина является обычным методом определения молекулярного веса белков в диапазоне 80 10 —1,4 10 дальтон [7] (см. табл. 35.1). На основании эмпирического уравнения [c.428]

Метод 1 [Myers et al., 1980]. После предварительной очистки препарат вносили на короткую колонку (1x5 см) DEAE-целлюлозы элюцию вели 0,3 М К-фосфатным буфером (pH 7,2), содержавшим 2 мМ ДТТ, 10% глицерина и 0,2% NP-40 (вероятно, статический вариант хроматографии). На втором этапе очистку проводили в режиме динамической хроматографии с помощью точно такого же элюента, но на колонке СМ-сефарозы L-6B длиной 59 см. [c.308]

Рис. 137. Аффинная хроматография карбоксипептидазы А на связанной с сефарозой бензилянтарной кислоте с конкурентной элюцией различными концентрациями свободного лиганда [ ueni et al, 1980]

Случае была saMetHo прочнее, 4to позволило промывать колонку с сорбированным па пей препаратом 0,15 М раствором КСЛ в буфере, а элюцию вести линейным градиентом 0,15—0,9 М КС1. ДНК-по-лимеразная активность выходила широким пиком в ее последующей очистке использовалось еще три варианта аффинной хроматографии на генарин-сефарозе, ДНК-целлюлозе п олиго((1Т)-целлюлозе. [c.422]

Примеры И, 12. Очистка рецепторов гормонов. Рецепторы гормонов зачастую содержатся в тканях-мишенях в ничтожно малых концентрациях, но, как уже указывалось, обладают очень высоким сродством к гормонам, поэтому аффинная хроматография — единственный эффективный способ их очистки. Рецепторы тироид-ных гормонов экстрагируют из ядер концентрированными солевыми растворами. Очистку рецептора для 3,5,3 -трийодтиронина (Тз) из такого экстракта вели на колонке сефарозы с иммобилизованным [c.432]

Смит II соавторы с помощью аффинной хроматографии очищали рецептор прогестерона человека. Содержание рецептора в матке составляет лишь 0,002% суммарного белка, и оп весьма лабилен. В качестве лиганда использовали 11-дезоксикортикостерон. Гормон сажали на Br N-активнрованную сефарозу 41 в виде конъюгата с бычьим сывороточным альбумином. Полученный таким образом аффинный сорбент инкубировали 18 ч с частично очищенным цитозолем матки, промывали 0,4 М КС1 и элюировали мкМ раствором меченного тритием прогестерона. Рецептор выходил в комплексе с гормоном. Операция обеспечивала очистку в 10 ООО раз. Вместе с предварительной 6-кратной очисткой цитозоля осаждением сульфатом аммония это позволило авторам получить гомогенный препарат рецептора [Smith et al., 1981). [c.434]

Пример 14. Очистка полн(А)-РНК на олиго((1Т)-целлюлозе [Bantle et al., 1976]. Метод очпстки полп(А)-РНК из суммарной РНК полисом аффинной хроматографией на олиго(с1Т)-целлюлозе пользуется чрезвычайно широкой популярностью благодаря своей простоте и эффективности. Существенным преимуществом этого сорбента по сравнению с полп(и)-сефарозой является его неуязвимость для рибонуклеаз, присутствующих, как правило, в очищаемых препаратах РНК. [c.445]

Наиболее широкое распространение среди носителей для гель-хроматографии белков получили сорбенты, приготовленные на основе декстрана (сефадексы, сефакрилы, молселекты), полиакриламида (биогели Р, акрилексы) и агарозы (сефарозы, биогели А) и др. Набухая в воде, они образуют гели. [c.106]

Хроматография на Ультрагеле АсА-44, ионообменная хроматография на ДЕАЕ-и ЗЕ-сефадексе, конканавалин-А-сефарозе [c.124]

Хроматография на фенил-сефарозе. Разбавленный в два раза буфером Б элюат с ДЭАЭ-ТСК после добавления в него СаСЬ до конечной концентрации 1 мМ наносят на колонку с фенил-сефарозой, предварительно уравновешенную буфером Б, содержащим 1 мМ a l2-Объем колонки 20 мл. Смолу промывают буферным раствором Б, содержащим 0,1 М Na l и 1 мМ СаСЬ до исчезновения показаний оптической плотности при длине волны 280 нм 1иа увикорде) в диапазоне 0,05 опт. ед. Скорость промывки — 1 мл/мин. Элюцию фосфодиэстеразы с фенил-сефарозы проводят буфером В. Скорость элюции— [c.380]

Повторная хроматография на ДЭАЭ-ТСК. Элюат с фенил-сефарозы наносят на колонку ДЭАЭ-ТСК объемом 20 мл, предварительна уравновешенную буфером В, и промывают 60 мл этого буфера. Элюцию фермента осуществляют линейным градиентом Na l (О—0,3 М) в буфере В. Объем буфера в камерах градиентатора — 2x100 мл. Скорость элюции — 2 мл/мин. Фракционирование необходимо проводить в пробирки по 4 мл. [c.380]

Совершенствование аффинной хроматографии также позволило использовать очень специфическую технику очистки. Китаму-ра и др. [59] очищали И S-глобулин сои, пропуская экстракт через колонку сефароза — конканавалин А. Глобулин 7S, который представляет собой гликопротеин, удерживается в геле, тогда как И S-глобулин элюируется. Кэйзи [17] изолировал легумин гороха иммунной аффинной хроматографией на колонке сефарозы, в которую введен IgG-антилегумин. По свидетельству этого автора, данный метод можно применить ко всему набору сортов гороха, несмотря на некоторую генетическую изменчивость состава легумина. [c.155]

В настоящее время применяют ряд усовершенствованных методов разделения нуклеиновых кислот на фракции из суммарного препарата, полученного описанным методом. Это прежде всего хроматография на геле фосфата кальция, ионообменная хроматография (в качестве адсорбентов используют ДЭАЭ-целлюлозу, ДЭЛЭ-сефадекс и др.), ультрацентрифугирование в градиенте плотности сахарозы, хроматография по сродству на белковых носителях, фильтрация через гели агарозы и сефарозы, гель-электрофорез и др. [c.97]

Агароза Сефароза СМ-сефароза Поперечно сшитый полиса-1 харид на основе нейтрального компонента агара Сшивка -СН2-СН(0Н)СН2-0-СН2- образуется в результате взаимодействия с 2,3-дибромпро-панолом Карбоксиметильная -О-СНг -СОО- Для фракционирования очень крупных молекул, высокополимерных ДНК вплоть до вирусов Носитель для аффинной хроматографии Катионообменная хроматография [c.239]

Методы разделения, основанные на использовании специфичного сродства биополимера к определенному партнеру, получили название аффинных методов разделения (от англ. affinity — сродство). Наиболее широко используемый вариант аффинных методов — это использование аффинных сорбентов. Специфические лиганды ковалентно присоединяются к соответствующему носителю, и выделяемое вещество либо адсорбируется таким сорбентом, либо отделяется от остальных компонентов с помощью аффинной хроматографии с использованием того же аффинного сорбента. Разнообразие мыслимых аффинных сорбентов неисчислимо, и практически невозможно приготовить все сорбенты в коммерчески доступном виде. Оптимальным для большинства задач является наличие носителя с реакционноспособными группами, который по усмотрению исследователя может быть использован для присоединения соответствующего лиганда, подходящего для решения поставленной задачи по разделению. Количество подобных реакционноспособных носителей весьма велико. Наиболее популярной является бромци-ансефароза, представляющая собой сефарозу, обработанную ВгС , который реагирует с гидроксигруппой сефарозы, превращая ее в остаток цианата [c.246]

Пептиды из нитрованного лизоцима, содержащие остатки нитротирозина, выделяли на сефарозе (Sepharose) с иммобилизованными антителами [45] (рис. 34.16). Антитела получали иммунизацией кроликов и коз комплексом нитротирозин—белок. Антитела выделяли из сыворотки методом аффинной хроматографии на сефарозе с фиксированным нитро-у-глобулином [46]. После десорбции 0,1 М уксусной кислотой антитела конденсировали с сефарозой, получая, таким образом, иммуносорбент. Последний использовали для выделения в одну стадию пептидов с остатком нитротирозина. [c.415]

Выделение пептидов с остатками цистеина на ртутьсодержащих адсорбентах осуществляется благодаря образованию ковалентных связей и на этом основании может рассматриваться как первый пример ковалентной хроматографии. В ряде работ было описано получение ртутьпроизводных сефарозы [51, 52], целлюлозы [53], сефадексов [54] и сополимера малеиновой кислоты с этиленом [55]. На последнем адсорбенте были выделены SH-пептиды из пептического гидролизата восстановленного инсулина [56]. После элюирования меркаптоэтанолом SH-группы карбоксиметилировали и смесь пептидов разделяли обычными методами. [c.417]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология