Рецептор lq очистка

Очистка рецепторов гормонов [c.192]

Можно ли считать, что дигидропиридиновый рецептор представляет собой Са-канал или хотя бы его часть Для ответа на этот вопрос была проведена очистка рецептора и его встраивание в искусственные бислойные мембраны. Установлено, что рецептор дигидропиридинов представляет собой глико- [c.42]

Исключительно важное значение химия поверхности адсорбентов и носителей имеет в газовой и жидкостной хроматографии для анализа сложных смесей, препаративного выделения чистых веществ и управления технологическими процессами. Химия поверхности играет важную роль и в процессах, протекающих в биологических системах. К ним относится, в частности, взаимодействие биологически активных веществ, в том числе лекарственных препаратов, с рецепторами — местами их фиксации в организме. Изучение модифицирования поверхности необходимо для решения вопросов совместимости искусственных материалов с биологическими. Химическое модифицирование адсорбентов применяется при разработке эффективных методов вывода из крови разного рода токсинов (гемосорбция). Прививка к поверхности крупнопористых адсорбентов и носителей соединений с определенными химическими свойствами необходима для иммобилизации ферментов, их хроматографического выделения и очистки, а также для иммобилизации клеток. Иммобилизованные ферменты и клетки эффективно используются в промышленном биокатализе, обеспечивая высокую избирательность сложных реакций в мягких условиях. Очистка и концентрирование вирусов гриппа, ящура, клещевого энцефалита и других для получения эффективных вакцин требует применения крупнопористых адсорбентов с химически модифицированной поверхностью. [c.6]

Структурные зонды для идентификации специфических особенностей на поверхности клеток Наборы реактивов ддя диагностики беременности Выявление эстрогенных рецепторов для диагностики некоторых форм рака молочной железы Точное определение количества специфических антигенов Очистка антигенов, например интерферона [c.18]

Аффинная хроматография — один из главных методов очистки белков — основана на взаимодействии между двумя биологически активными веществами, одно из которых обычно ковалентно присоединено к инертному носителю. Аффинная хроматография используется для очистки белков — антител, ферментов, гормонов, рецепторов — и других биополимеров — полисахаридов и нуклеиновых кислот, а также биологических макрочастиц, например вирусов и клеток. [c.180]

Сорбент III был использован для выбора оптимальных условий очистки рецептора катехоламина из мембран эритроцитов индюка в статических ус- [c.193]

Использование сорбента П1 позволяет осуществить 20 000-кратную очистку рецепторов плазматической мембраны эритроцитов за один хроматографический цикл. Выход составляет 25—30%. Метод был также успешно применен для очистки р-рецептора эритроцитов лягушки [3]. [c.195]

Выделение и очистка рецепторов [c.8]

Методы очистки рецепторов основаны иа технике аффинной хроматографии. В качестве специфических сорбентов применяют иммобилизованные на сефарозе лиганды. Ниже кратко изложены несколько методических процедур, дающих представление о технике очистки ряда рецепторных белков. [c.8]

Выбранную культуру клеток можно выращивать на поверхности культурального флакона в стационарных условиях или в роллерной установке (в последнем случае используют бутылки и пробирки), а также в суспензии при осторожном перемешивании. Клетки наращивают до монослоя или высевают с нужной плотностью из трипсинизированной культуры за сутки до использования (хотя следует помнить о чувствительности рецепторов пикорнавирусов к протеазам [12]). В нашей лаборатории оказалось наиболее удобным использовать для получения небольших количеств (до 100 мкг) полиовируса вращающиеся пробирки, поскольку в них значительное количество клеток (Ю клеток на площади 66 см ) покрывается небольшим объемом среды (1 мл), что обеспечивает экономный расход радиоактивных соединений и позволяет получить препарат вируса, не требующий концентрирования перед очисткой. Культивирование полиовируса в роллерных установках обычно дает такой же выход и удельную радиоактивность, как и выращивание в монослое на флаконах при одинаковых концентрациях клеток, вируса и радиоактивного предшественника. Риновирусы, однако, предпочтительнее выращивать в роллерных культурах, поскольку для их репродукции нужны хорошая аэрация и слабокислый pH, хотя сами вирионы в кислой среде лабильны. [c.48]

По своему существу аффинная хроматография — это особый тип адсорбционной хроматографии. В отличие от того, что было описано в гл. 6, адсорбция здесь осуществляется за счет биоспецифп-ческого взаимодействия между молекулами, закрепленными на матрице, т. е. связанными в неподвижной фазе, и комплементарными к ним молекулами, подлежащими очистке или фракционированию, поступающими, а затем элюируемыми с подвижной фазой. Биоспеци-фическое взаимодействие отличается исключительной избирательностью, а зачастую и очень высокой степенью сродства между партнерами. Оно лежит в основе множества строго детерминированных процессов, протекающих в организме. В качестве примеров можно назвать взаимодействия между ферментами и их субстратами, кофакторами или ингибиторами, между гормонами и их рецепторами, между антигенами и специфическими для них антителами, между нуклеиновыми кислотами и специфическими белками, связывающимися с ними в процессе осуществления своих функций (полимераза.мп, нуклеазами, гистонами, регуляторными белками), а также между самими нуклеиновыми кислотами-матрицами и продуктами их транскрипции. Наконец, многие малые молекулы (витамины, жирные кнслоты и др.) специфически связываются со специальными транспортными белками. [c.339]

Белки-рецепторы могут служить лигандами для связывания гормонов п других низкомолекулярных эффекторов, транспортные белкп плазмы и белки-переносчики клеточных мембран — для связывания и очистки своих низкомолекулярных партнеров. Белки-регуляторы и участники процессов матричного синтеза, используемые в качестве лигандов, позволяют решать задачи по вычленению регуляторных участков нуклеиновых матриц и выявлению других компонентов синтезирующих систем. То же самое относится к системам выработки и транспорта энергии. [c.362]

Примеры И, 12. Очистка рецепторов гормонов. Рецепторы гормонов зачастую содержатся в тканях-мишенях в ничтожно малых концентрациях, но, как уже указывалось, обладают очень высоким сродством к гормонам, поэтому аффинная хроматография — единственный эффективный способ их очистки. Рецепторы тироид-ных гормонов экстрагируют из ядер концентрированными солевыми растворами. Очистку рецептора для 3,5,3 -трийодтиронина (Тз) из такого экстракта вели на колонке сефарозы с иммобилизованным [c.432]

Смит II соавторы с помощью аффинной хроматографии очищали рецептор прогестерона человека. Содержание рецептора в матке составляет лишь 0,002% суммарного белка, и оп весьма лабилен. В качестве лиганда использовали 11-дезоксикортикостерон. Гормон сажали на Br N-активнрованную сефарозу 41 в виде конъюгата с бычьим сывороточным альбумином. Полученный таким образом аффинный сорбент инкубировали 18 ч с частично очищенным цитозолем матки, промывали 0,4 М КС1 и элюировали мкМ раствором меченного тритием прогестерона. Рецептор выходил в комплексе с гормоном. Операция обеспечивала очистку в 10 ООО раз. Вместе с предварительной 6-кратной очисткой цитозоля осаждением сульфатом аммония это позволило авторам получить гомогенный препарат рецептора [Smith et al., 1981). [c.434]

Хроматографические методы, в которых разделение компонентов смеси основано на различии в размерах, форме или суммарном заряде молекул, часто недостаточно эффективны для разделения смесей белков. В таких случаях может оказаться полезной аффинная хроматография [48]. Успех метода зависит от того, удастся ли найти вещество, которое будет специфически взаимодействовать с подлежащим очистке белком. Для фермента таким веществом может быть конкурентный ингибитор катализируемой этим ферментом реакции, а для участвующего в гормональной регуляции белка-рецептора — соответствующий гормон. Это вещество связывают с подходящим нерастворимым гидрофильным носителем, и полученный материал используют при хроматографии как стационарную фазу. Вещества такого типа часто сами оказываются большими природными макромолекулами, и приемы, используемые для соединения их с носителями, сходны с методами приготовления иммобилизованных ферментов [см. разд. 27.4.2 (5)]. Реакции, с помощью которых белки, содержащие аминогруппы или фенольные группировки, могут быть связаны с носителем на основе сшитого полиакриламида, содержащего некоторое число гидразидных или 4-аминоанилидных остатков (схемы 30, 31 Б — остаток белка). Хорошие результаты получены в тех случаях, [c.322]

Поскольку в электропластинках Torpedo на долю ацетилхолинового рецептора приходится 2% мембранного белка, достаточно всего 50-кратной степени очистки для получения этого рецепторного белка в чистом виде. Напротив, для выделения ацетилхолинового рецептора из мышц необходима >10 000-кратная степень очистки. Но даже и это достигается только с применением специального приема — использования денервиро-ванной мышцы, а денервация сама по себе приводит к 20-кратному увеличению концентрации рецептора (см. ниже). [c.264]

Биохимия этих допаминовых рецепторов изучена очень плохо. Очистка рецепторных белков оказалась сложной из-за отсутствия богатого источника рецепторов, например число бути-рофенонсвязывающих центров (Ог) в полосатом теле мозга быка составляет только 450 фмоль/мг белка или 50 пмоль/г ткани. [c.281]

Использование радиолигандного метода позволило приступить к выделению и очистке рецепторов гормонов из мембран. В настоящее время многие рецепторы получены в достаточно гомогенной форме, определены их коэффициент седиментации, молекулярная масса, радиус Стокса, степень гидрофобности и т. д. Рецепторы нескольких гормонов выделены в высокоочищенном виде. Удалось показать, что в большинстве случаев гормональные рецепторы — это гликопротеины. [c.239]

Лишь в 1923 г. в Германии Ю. Брауном и В. Кайзером было начато систематическое изучение зависимости запаха от оптической активности соединений. На этих исследованиях мы остановимся более подробно, поскольку в свое время они способствовали накоплению фактического материала о зависимости запаха от оптической активности соединений и явились началом целенаправленного изу Чения запаха энантиомеров и рацемических соединений. Предпосылкой для возникновения этих работ, как указывали Браун и Кайзер [174], послужило появление сообщений о различии свойств антиподов, в частности, о различии их вкуса. Здесь, но-видимому, авторы имели в виду работу Пьюти [175], в которой сообщалось о различии вкуса стереоизомеров аспарагина (+)-изомер — сладкий вкус, (—)-изомер — без вкуса, а также исследования Фишера, установившего различие вкусов антиподов глутаминовой кислоты [176] и лейцина [177]. Исходя из этих фактов, Браун и Кайзер предположили возможность различного воздействия оптически активных веществ на обонятельные рецепторы, однако отмечали, что точных экспериментальных данных, подтверждающих различие запахов таких изомеров, не имеется. Работу Вернера и Конрада [173] они назвали небезупречной , поскольку очистка (+)-и (—)-диметило-вых эфиров г/ акс-гексагидрофталевой кислоты. .. была недостаточной для того, чтобы. .. полностью исключить наличие примесей, влияюпщх на запах [174, стр. 2268]. Тридцать лет спустя было показано, что это предположение Брауна и Кайзера справедливо [178]. [c.130]

Содержание других рецепторов очень мало, и это препятствовало проведению их очистки и анализа. В настоящее время методы генной инженерии позволяют получать необходимое количество материала, и такие исследования стали активно развиваться. Удалось показать, что рецептор инсулина представляет собой гетеротетрамер (а, Pj), в котором субъединицы соединены множественными дисульфидными связями выступающая из мембраны а-субъединица связывает инсулин, а пронизывающая мембрану Р-субъединица обеспечивает передачу сигнала, вероятно, при участии тирозинкиназы, составляющей цитоплазматическую часть этого полипептида. Рецепторы инсулиноподобного фактора роста [c.154]

Настоящий раздел посвящен достижениям рентгеноструктурного анализа белков, знание пространственного строения которых представляет для человека поистине жизненный интерес. Речь пойдет об аспартатных протеиназах, прежде всего протеиназе вируса иммунодефицита человека (HIV) и ренине, одних из главных участников системы регуляции тонуса стенок кровеносных сосудов, скселетных мышц и других тканей. Ниже показано, что поиск радикальных терапевтических средств борьбы с синдромом приобретенного иммунодефицита (AIDS), другими видами вирусных заболеваний, гипертонией, т.е. решение сугубо прикладных задач экстраординарной важности, требует высокого уровня развития теоретической молекулярной биологии. Необходимой, хотя и не в полной мере достаточной, предпосылкой для его достижения является информация о трехмерных структурах соответствующих белковых молекул. В отличие от структурных исследований мембранных рецепторов, сдерживающим моментом здесь служат не трудности выделения, очистки и кристаллизации белков, а сложности более принципиального порядка. [c.80]

Клеточные рецепторы принадлежат к числу мембранных белков. Участок молекулы рецептора, пронизывающий цитоплазматическую мембрану, построен из неполярных аминокислот, в силу чего между (П1м и липидныуп компонентами мембраны осуществляются гидрофобные взаимодепствия. Помимо них рецепторные белки образуют в ряде случаев ковалентные сложноэфирные связи с остатками фосфорной кислоты фосфолипидов мембраны (рис. 1). Тесная связь рецепторного белка с клеточной мембраной диктует необходимость использования для выделения рецепторов солюбилизирующих мембрану детергентов. С целью дополнительной очистки в ряде случаев прибегают к удалению из препаратов рецепторных белков ковалентно присоединенных к ним комг-оиентов клеточной мембраны. [c.8]

При анализе методов, используемых для выделения клеточных рецепторов, обращает на себя внимание стремление к применению максимально щадящих методов на стадии элюции рецептора с сорбента. Так, применение сорбентов с иммобилизованными лактинами для очистки рецептора инсулина продиктовано прежде всего стремлением избежать воздействия на рецепторный белок растворов с низкими значениями pH, концентрированных растворов амидов (мочевина) или других денатурирующих белок веществ. В то же время в кислой среде (или с применением денатурирующих агентов) производится элюция с иммобилизованных лигандов (антигены или гаптены) различных по специфичности антител, не приводящая к их инактивации. Различие подходов к способам элюции клеточных рецепторов и антител (иммуноглобулины) с иммобилизованных лигандов, выбранных эмпирическим путем, связано с конформационнон лабильностью рецепторных белков. Так, для ряда изученных к настоящему времени рецепторов (например, рецептор для эпидермального фактора роста) характерны выраженные изменения конформации при переходе из нейтральной в слабокислую среду (см. гл. 3). [c.11]

Наиболее щадящие методы элюции рецепторных белков с иммобилизованных лигандов могут заключаться в вытеснении рецептора с помощью структурного аналога лиганда. Примечателен в этом отношении метод очистки п- дренергического рецептора. В качестве сорбента применяют иммобилизованный на -сефарозе алпренолол, имеющий выраженное сродство к упомянутому рецептору. Последующую элюцию рецептора с сорбента осуществляли е помощью раствора алпренолола. [c.11]

Выше обращали внимание на необходимость тщательной проверки чистоты препаратов клеточных рецепторов, выявление в изучаемом препарате примеси клеточных ферментов. Так, нанрп-мер, было установлено присутствие в препаратах рецептора гормона роста фермента — фосфотидилннозиткиназы. Последняя выделяется вместе с рецептором даже при иснользовании для его очистки методов аффинной хроматографии на иммобилизованном гормоне или иммобилизованных моноклональных антителах против рецептора (D. М. Thompson et al., 1985). Несмотря на эти факты, существуют веские основания утверждать, что у рецептора гормона роста имеется собственная ферментативная активность, в том числе эндонуклеазная. Об этом свидетельствуют следующие наблюдения. [c.31]

Известно, что клетка млекопитающих способна синтезировать ориентировочно З-Ю" различных белков и экспрессировать до 5-10 этих белковых молекул на плазматической мембране в любой момент времени. Совершенно очевидно, что наши представления о биологии мембран лимфоцитов далеко не полны. Это особенно четко видно на примере исследования связей между мембранными структурами и их функциями. Например, в предпринятых недавно попытках создать каталог компонентов мембран выявилось большое число молекул с неизвестной функцией, так называемых молекул- сирот . Эти молекулы были идентифицированы при использовании некоторых схем очистки, но их функциональная роль остается неясной. Обычно при иммунопреципитации с использованием моноклональных антител (МА) против целых клеток нлп мембранных везикул выявляется новая детерминанта, и после этого соответствующие МА пытаются использовать в качестве индукторов или ингибиторов в каком-либо тесте функциональной активности лимфоцитов. Модулируемые МА проявления активности лимфоцитов позволили выяснить связь некоторых неисследованных ранее компонентов плазматических мембран с физиологическими процессами. Примерами таких компонентов мембран могут служить молекула ЬуЬ 2 (ЗиЬЬагао, Мо51ег, 1982), семейство высокомолекулярных гликопротеинов Ьу5 (Уакига е1 а ., 1983) и Т11-рецептор (эритроцитарный) (Меиег е а1., 1984), Однако функции большинства охарактеризованных к настоящему времени мембранных компонентов остаются неизвестными. [c.173]

Хроматографию по сродству обычно применяют для очистки одногр компонента системы, состоящей из двух или более взаимодействующих веществ. Основной принцип заключается в прикреплении одного компонента к нерастворимой пористой матрице (иммобилизация). Связанный компонент (лиганд) может быть использован для специфической сорбции другого компонента в условиях, благоприятных для их взаимодействия и образования комплекса. Элюция сорбированного вещества может включать любую процедуру, ведущую к диссоциации. комплекса. Для очистки ферментов чаще всего используют конкурентные ингибиторы, связанные с носителями. В качестве лигандов могут быть взяты также кофакторы, субстраты ли фрагменты субстратов. В иммунологии хроматографию по сродству широко применяют для очистки антител на связанных антигенах и для выделения антигенов на связанных антителах. Метод с успехом используют для выделения белков-рецепторов, связывающих витамины и гормоны. ХрО матографию по сродству примедяют также для концентрирования разбавленных белковух растворов, удаления денатурированных или модифицированных ферментов из активных препара- [c.215]

Мутационная замена Asn Ala в С-концевой части интеина блокирует последнюю стадию сплайсинга рекомбинантного белка (см. рис. 39), при конструировании которого нуклеотидная последовательность целевого белка 1 была объединена в коммерческом экспрессирующем векторе в одной рамке считывания с последовательностями нуклеотидов мутантного интеина и хитин-связыва-ющего домена ( BD) бактериальной хитиназы. Последний в рекомбинантном белке выполняет роль лиганда, взаимодействующего с иммобилизованным рецептором (хитином), что необходимо для очистки белка с помощью аффинной хроматографии после связывания хроматографическим носителем целевой белок вырезается из полипептида с помощью добавленного тиола (R-HS) в реакции межмолекулярной трансэтерификации, и образовавшееся производное может быть далее лигировано с пептидом, содержащим остаток a- ys. Таким образом, процесс EPL объединяет в себе две стадии тиолиз с участием интеина и спонтанное химическое лигирование нативных белков [c.314]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология