Инсулин восстановление активности

То, что водородная связь образуется именно с карбоксильным ионом, а не с незаряженным карбоксилом, было доказано спектроскопически. При переходе от pH 1,5, когда СООН-группа не заряжена, к pH 5 происходит заметное смещение (на 6 ммк) полосы поглощения белка при 280 ммк, которое объясняется образованием водородной связи. Две такие связи были обнаружены в молекуле инсулина и три — в молекуле рибонуклеазы. Подобного рода связи играют важную роль в сохранении третичной структуры некоторых белков. Так, при обработке рибонуклеазы (5-меркаптоэтанолом в 8 М мочевине (агент, разрушающий водородные связи) происходили разрыв 5—5-мостиков и полная инактивация фермента. Однако после удаления этих агентов и окисления сульфгидрильных групп кислородом воздуха наблюдалось полное восстановление активности и числа 5—5-связей. Очевидно, что образование этих связей происходило в тех же местах, что и в нативном белке. Если же и окисление 5Н-группы проводилось в 8 М мочевине, то активность фермента не восстанавливалась, хотя и наблюдалось полное восстановление числа дисульфидных связей. Вероятно, восстановление этих связей проходило в полном беспорядке, хаотично, и белок остался денатурированным. [c.116]

Наиболее трудоемким и важным вопросом химии инсулина (а также ряда других природных белков и пептидов, имевших связи S—S) является вопрос о создании из восстановленных (природных или синтетических) цепей, содержащих цистеиновые остатки, та ких пептидов, в которых цистиновые мостики связывали бы соответствующие амино кислотные остатки в таком же порядке, в каком они связаны в природном пептиде, так как только в этом случае могут быть получены синтетические препараты, обладающие полной биологической активностью природных соединений. [c.698]

Активность инсулина понижается при восстановлении дисульфидных связей сероводородом, цистеином или тиогликолевой кислотой. Примерно половина активности теряется, когда восстановлены только одна илн две дисульфидные группы. В этом случае единственным химическим изменением, которое можно заметить, является появление нескольких сульфгидрильных групп. Активность не восстанавливается при окислении обычными методами, что может быть объяснено на основании следующей схемы [c.699]

Согласно данным Ду и сотр. [2731], степень активности, генерируемой восстановлением и последующим окислением смеси 8-сульфонатов цепей А и В, зависит от соотношения компонентов, причем наиболее высокий уровень активности наблюдается при молярном соотношении цепей А и В, равном 1,5 1. Полученное таким образом вещество обладало активностью 12 М. Е./жг, что составляет приблизительно 50% активности кристаллического инсулина. Оптимальные условия рекомбинации [c.474]

Ван и сотр. [2777] использовали синтетическую защищенную цепь А, которую после восстановления натрием в жидком аммиаке окисляли вместе с 5-сульфонатом природной цепи В. Выделенное вещество обладало активностью, составляющей 2% активности природного инсулина. [c.489]

Группа работников Института биохимии в Шанхае [40, 411 получила замечательные результаты по восстановлению активности инсулина из полностью неактивных 5-сульфоглицильных и фенил-аланильных цепей после их восстановления тиогликолатом и последующего окисления. При очистке этого окисленного продукта было получено кристаллическое вещество, идентичное кристаллическому инсулину и обладавшее активностью, равной 18,4 международной единицы на 1 мг. В течение ряда лет увлекательная задача ресинтеза инсулина из его восстановленных разделенных пептидных цепей привлекала внимание многих исследователей. Проведя математический анализ вероятности образования 12 возможных изомеров, содержащих по одной из двух цепей, Кауцман [42] показал, что вероятность получения структуры нативного инсулина составляет около 5%. Удельная активность продуктов регенерации, полученных в упомянутой новой работе, составляла обычно 5—10% удельной активности кристаллического инсулина, а иногда достигала и 20%. Отсюда можно заключить, что среди 12 возможных изомеров структура нативного инсулина является одной из наиболее стабильных. [c.110]

Для полного восстановления обычно необходимо использовать тиол и реагент, вызывающий разрыв водородных связей, а следовательно, и разделение пептидных цепей. Так, инсулин полностью восстанавливается только тногликолятом в присутствии 8 М раствора мочевины [202], а электрофорез на бумаге в 8 М растворе мочевины позволяет разделить две полипептидные цепи. В отсутствие мочевины цистин восстанавливается не более чем на з- Степень восстановления дисульфидных связей рибонуклеазы [282] также определяется концентрацией мочевины. Тиогликолят при pH 7 в отсутствие поверхностно-активного вещества [209] или гуанидина [171] восстанавливает только одну цистиновую связь из 17 связей, имеющихся в альбуминах человека и быка (мол. вес 65 000). В 0,2 М растворе натриевой соли децилсульфата при pH.7 в течение 1 час при комнатной температуре восстанавливаются все цистиновые связи. [c.172]

Известно, что многие ферменты содержат в активном центре 8Н-груп-пы, абсолютно необходимые для каталитической реакции. При их окислении ферменты теряют свою активность. Предполагают, что одной из главных функций глутатиона является сохранение этих ферментов в активной восстановленной форме. Окисленный глутатион может восстанавливаться под действием глутатионредуктазы, используя НАДФН. Кроме того, глутатион может оказывать ингибирующее действие на некоторые белки. В частности, известная реакция инактивации инсулина под действием глутатионинсулинтрансгидрогеназы, в которой 8Н-глутатион является донором водородных атомов, разрывающих дисульфидные связи между двумя полипептидными цепями молекулы инсулина. Установлена также коферментная функция глутатиона, в частности для глиоксилазы I. Ранее обсуждалось участие глутатиона в транспорте аминокислот через клеточную мембрану. [c.453]

Наиболее убедительным доказательством того, что первичная структура определяет вторичную и третичную, могут, по-видимому, служить опыты по восстановлению нативной структуры белка после денатурации ренатура-ция белка). Если, например, полностью развернуть молекулу рибонуклеазы путем восстановления четырех ее дисульфидных мостиков меркаптоэта-нолом в 8 Af мочевине, а затем вызвать реокисление таких развернутых молекул в контролируемых условиях, то молекулы (от 95 до 100%) вновь приобретают нативную конформацию, что подтверждается восстановлением не только физических свойств, но и ферментативной активности. Этот опыт схематически представлен на фиг. 42. Статистические расчеты показывают, что если бы реконструкция дисульфидных мостиков происходила совершенно произвольно, то нативную конформацию приобретало бы лишь небольшое число молекул —около 1%. В табл. 20 приведены данные по рена-турации некоторых белков. Во всех случаях, за исключением инсулина, степень восстановления нативных структур значительно превышает величину, которой следует ожидать, исходя из статистических соображений. Эти данные вовсе не означают, однако, что процесс образования дисульфидных связей в белках может протекать in vivo без направленного катализа. Реконструкция нативных белковых структур после восстановительного разрыва дисульфидных мостиков представляет собой слишком медленный процесс, не соответствующий скорости синтеза биологически активных белков [c.113]

Эта реакция часто использовалась для доказательства роли дисульфидных групп в активности ферментов или гормонов. Например, при восстановлении всех дисульфидных групп рибону-клеазы или инсулина полностью исчезает биологическая активность этих веществ. Последующее обращение этого процесса с помощью мягких окислителей не всегда возвращает исходную активность, ибо дисульфидные связи иногда образуются хаотически, что нарушает исходную третичную структуру белка. Примером может служить инсулин, у которого регенерация дисульфидных связей приводит к восстановлению лишь 2% первоначальной активности. Реакция восстановления дисульфидных групп отличается от процесса инактивирования ЗН-групп при окислении [c.66]

Восстановительное расщепление при действии боргидрида лития носит избирательный характер. В молекуле инсулина расщепление особенно активно протекает по одному из остатков глицина, В некоторых белках лабильны, по-видимому, пептидные связи, образованные остатками глутамина и аспарагина. В табл. 29 приведен перечень остатков дикарбоновых кислот, амидов дикарбоновых кислот и С-концевых остатков, присутствующих в немодифи-цированном белке вместе с перечнем соответствующих продуктов, присутствующих в гидролизате этерифицированного и восстановленного белка. В табл. 30 приведен анализ продуктов, полученных из [c.196]

Вливание ангиотензина в дозах 0,001—0,01 мкг/кг/мин вызывает у человека резкое повышение антидиуретической активности, причем концентрация натрия и хлоридов в моче практически не меняется, а концентрация калия значительно возрастает. Вообще дозы ангиотензина около 10" г/кг/мин оказывают сильное влияние на баланс электролитов и функции почки напротив, альбуминурия при этом не наблюдалась [260]. Ангиотензин по--нижает также скорость удаления п-аминогиппуровой кислоты и инсулина [262]. Организм человека, страдающего гипертонией, иначе реагирует на введение ангиотензина. В этом случае наблюдается увеличение скорости выделения в почечном клубочке, выделения мочи и электролитов, что объяснялось влиянием повышенного кровяного давления, при приведении которого к нормальному уровню может иметь место восстановление антиди-уретического эффекта [4 За, 1707]. [c.43]

Разрушение дисульфидных мостиков в молекуле инсулина путем восстановления [2208] или окисления [765] сопровождается полной потерей активности. Хотя ряд исследователей [726, 1613] указывали, что изолированные цепи А и В все еще обладают некоторой остаточной активностью, эти данные нельзя считать достоверными, поскольку не исключалось присутствие следов природного инсулина. Диксон и Уордлоу [604] расщепляли ди- [c.472]

Диксон и Уордлоу [604] окислением 5-сульфонатов цепей А и В при pH 8,5—9,0 получили смесь веществ, активность которой составляла 1—2% активности инсулина. Ду и сотр. [618] для получения 5-сульфонатов цепей А и В восстанавливали инсулин сульфидом натрия и тетратионатом натрия. Продукты восстановления удалось разделить хроматографией на дауэксе 50-Х2 или зональным электрофорезом на целлюлозном порошке. Восстановление полученных таким образом 5-сульфонатов осуществляли обработкой избытком тиогликолевой кислоты. При аэробном окислении (pH 8,5) чистой цепи А или чистой цепи В не образуется никаких активных соединений. Напротив, в этих же условиях из смеси цепей А и В получается вещество, активность которого составляет 5—10% активности инсулина. Взаимодействие одной цепи, находящейся в сульфгидрильной форме, с 5-сульфонатом другой цепи также приводит к образованию инсулина. Более того, путем очистки продуктов окисления (1 г смеси с активностью 1,83 М. Е./жг) удалось выдел ить 28 мг кристаллического инсулина с удельной активностью 18,4 М. Е./жг (судорожный тест на мышах). Полученный таким образом инсулин не отличается от природного гормона по кристаллической структуре, а также по хроматографическому и электрофоретическому поведению. Идентичными оказались и пептидные карты продуктов ферментативного гидролиза этих двух соединений. Дальнейшее улучшение методики окислительной рекомбинации цепей А и В позволило Янгу и сотр. [1145] повысить выход инсулина до 50%. Эти данные свидетельствуют о том, что среди множества теоретически возможных продуктов окисления цепей А и В структура инсулина является предпочтительной. [c.474]

Заключаются в восстановлении S-сульфонатов цепей А и В 28-кратным избытком меркаптоэтанола (I00° pH 5 6 мин), осаждении и промывании восстановленных цепей при pH 3,8 и в окислении при концентрации белка 5 мг/мл (3—5° pH 10,6 глициновый буферный раствор). Цан и сотр. [2783] путем предварительного окисления цепи А кислородом воздуха (pH 8,8 60— 100 мин), последующего смешения продукта частичного окисления цепи А с восстановленной цепью В и дальнейшего окисления достигли степенл активности, составлявшей 44 14% активности инсулина. [c.475]

Тсоу и сотр. [2325] показали, что инсулин можно восстановить обработкой натрием в жидком аммиаке, а также тиогликолевой кислотой или борогидридом натрия. Последующая реакция восстановленного инсулина с хлористым бензилом приводит к образованию полностью бензилированного соединения. Окисление продуктов восстановления натрием в жидком аммиаке самого инсулина, смеси S-сульфонатов цепей А и В или смеси полностью бензилированных цепей А и В приводит к регенерации инсулиновой активности. Если в качестве исходного вещества взят продукт бензилирования, степень регенерации активности составляет 1—2%. а в случае инсулина и S-сульфонатов цепей А и В — 5—10%. [c.475]

Эти разнообразные алкилирующие агенты применялись главным образом для метилирования фибриллярных белков (шерсть, фиброин шелка и желатина) [75—77], при изучении структуры этих белков и при поисках их ценных производных. Серьезному исследованию был подвергнут также инсулин [78]. Чарльз и Скотт [79], обрабатывая инсулин йодистым метилом, добились почти полного инактивирования этого кристаллического гормона. Обработка разбавленной щелочью при 0° привела к восстановлению 30% его активности. Хотя сами ваторы и не считают, что инактивирование инсулина обусловлено этерификацией, другие исследователи впоследствии отмечали, что условия реакции были благоприятными для этерификации, и указывали на лабильность образовавшейся эфирной связи в щелочной среде [18, 19] (см. ниже). Иенсен и его сотрудники [80] сообщили об уменьшении содержания цистина в инсулине после обработки последнего диазометаном и йодистым метилом, а также об уменьшении содержания аминного азота при опытах с диазометаном. Оба эти реагента инактивируют инсулин обратимо. Возможно, что одновременно происходят как этерификация, так и метилирование. Помимо этих исследований, Гауровитцом [81] было произведено исчерпывающее метилирование гемоглобина и яичного альбумина диметилсульфатом, а Херриотт [18] сообщил, что при введении 15 метоксильных групп в молекулу пепсина последний инактивируется. [c.296]

И восстановление энергетических источников. В результате повышается концентрация норадреналина и адреналина (в 5—10 раз активнее норадреналина), глюкагона, глюкокортикостероидов и соматотропного гормона в крови. Однако концентрация инсулина чаще всего снижается. Указанные гормоны участвуют в регуляции концентрации глюкозы в крови следующим образом [c.273]

Полипептиды в растворе сохраняют способность к агрегации, поскольку у них имеются внутримолекулярные ковалентные связи, такие, как дисульфидные мостики. Если необходимо полностью разрушить эти связи, к солюбилизирующему агенту добавляют восстановители тиоловых групп — дитиотрейтол (ДТТ) или 2-меркаптоэтанол (2-МЭ). Другой метод, который может быть использован для разрушения внутримолекулярных дисульфидных связей, — получение производных в форме 5-сульфона-тов. Такой подход был использован в случае А- и В-цепей инсулина [11] (табл. 4.15). Есть ли необходимость в полном разрушении таких связей, можно определить, только исследуя процесс ренатурации белка и восстановления его активности. Не всегда необходимо полностью разрушать дисульфидные связи между отдельными цепями молекулы при ренатурации белковой молекулы можно создать условия, обеспечивающие тиол-дисульфидный обмен с образованием мономерных молекул, соединенных дисульфидными связями (разд. 4.3.5). [c.118]

Была исследована способность еще нескольких белков к образованию правильной структуры после восстановления дисульфидных связей. Для всех них кроме инсулина, явно выпадающего из общей картины, были получены сходные результаты. На рис. 1.11 показана структура инсулина она состоит из А-цепи, содержащей 21 остаток, и В-цепи, содержащей 30 остатков. А- и В-цепи соединены между собой двумя дисульфидными мостиками. Кроме того, в А-цепи имеется мостик между полуцистинами 6 и 11. При денатурации инсулина его цепи перепутываются, н гфи реокислении не удается получить достаточного количества нативного белка. Следует иметь в виду, однако, что in vivo инсулин синтезируется как белок-предщественник — проинсулин (см. рис. 1.11). Далее эта молекула подвергается ферментативному расщеплению, фрагмент из остатков с 31-го по 63-й удаляется, и получается функционально активный иноглин. При восстановлении и реокислении проинсулина иммунологическая активность, свойственная нативному белку, восстанавливается. Более того, обрабатывая такой проинсулин трипсином, можно получить биологически активный инсулин. Таким образом, дисульфидные связи самопроизвольно формируются в проинсулине и затем сохраняются в инсулине. Без них инсулин не способен принять нативную конформацию. Возникает естественный вопрос находится ли инсулин в термодинамически наиболее стабильной конформации, по крайней мере в отнощении расположения дисульфидных связей [c.274]

Аналогично ферментам в МЧ из окисленного Сефадекса был включен инсулин [9]. После присоединения инсулина и восстановления альдиминовых связей боргидридом в раствор выделялись водорастворимые конъюгаты с Л1 = 10, 50 и 150 тыс. (62, 40 и 30 мг белка на 1 г носителя в зависимости от степени окисления исходного Сефадекса), которые не высвобождали инсулин. В экспериментах на животных было показано, что все три конъюгата сохранили физиологическую активность исходного инсулина, а время проявления активности увеличилось с 5—6 ч до 14—16 ч. [c.223]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология