Очистка рецепторов гормонов

Очистка рецепторов гормонов [c.192]

Если такие антитела ввести животному другого вида, можно получить вторичные антитела, которые не будут обладать способностью взаимодействовать с гормоном, но будут связываться с рецептором этого гормона (см. рис. 56). Применение вторичных антител в качестве аффинного сорбента молсет сыгратЬ большую роль в очистке рецепторов. В настоящее время эти антитела широко применяются в изучении локализации рецепторов. Обычно их метят флуоресцирующими агентами, наносят на срезы тканей или в суспензии клеток, а. затем по локализации флуоресцирующего материала [c.140]

Аффинная хроматография — один из главных методов очистки белков — основана на взаимодействии между двумя биологически активными веществами, одно из которых обычно ковалентно присоединено к инертному носителю. Аффинная хроматография используется для очистки белков — антител, ферментов, гормонов, рецепторов — и других биополимеров — полисахаридов и нуклеиновых кислот, а также биологических макрочастиц, например вирусов и клеток. [c.180]

Примеры И, 12. Очистка рецепторов гормонов. Рецепторы гормонов зачастую содержатся в тканях-мишенях в ничтожно малых концентрациях, но, как уже указывалось, обладают очень высоким сродством к гормонам, поэтому аффинная хроматография — единственный эффективный способ их очистки. Рецепторы тироид-ных гормонов экстрагируют из ядер концентрированными солевыми растворами. Очистку рецептора для 3,5,3 -трийодтиронина (Тз) из такого экстракта вели на колонке сефарозы с иммобилизованным [c.432]

Использование радиолигандного метода позволило приступить к выделению и очистке рецепторов гормонов из мембран. В настоящее время многие рецепторы получены в достаточно гомогенной форме, определены их коэффициент седиментации, молекулярная масса, радиус Стокса, степень гидрофобности и т. д. Рецепторы нескольких гормонов выделены в высокоочищенном виде. Удалось показать, что в большинстве случаев гормональные рецепторы — это гликопротеины. [c.239]

Выше обращали внимание на необходимость тщательной проверки чистоты препаратов клеточных рецепторов, выявление в изучаемом препарате примеси клеточных ферментов. Так, нанрп-мер, было установлено присутствие в препаратах рецептора гормона роста фермента — фосфотидилннозиткиназы. Последняя выделяется вместе с рецептором даже при иснользовании для его очистки методов аффинной хроматографии на иммобилизованном гормоне или иммобилизованных моноклональных антителах против рецептора (D. М. Thompson et al., 1985). Несмотря на эти факты, существуют веские основания утверждать, что у рецептора гормона роста имеется собственная ферментативная активность, в том числе эндонуклеазная. Об этом свидетельствуют следующие наблюдения. [c.31]

По своему существу аффинная хроматография — это особый тип адсорбционной хроматографии. В отличие от того, что было описано в гл. 6, адсорбция здесь осуществляется за счет биоспецифп-ческого взаимодействия между молекулами, закрепленными на матрице, т. е. связанными в неподвижной фазе, и комплементарными к ним молекулами, подлежащими очистке или фракционированию, поступающими, а затем элюируемыми с подвижной фазой. Биоспеци-фическое взаимодействие отличается исключительной избирательностью, а зачастую и очень высокой степенью сродства между партнерами. Оно лежит в основе множества строго детерминированных процессов, протекающих в организме. В качестве примеров можно назвать взаимодействия между ферментами и их субстратами, кофакторами или ингибиторами, между гормонами и их рецепторами, между антигенами и специфическими для них антителами, между нуклеиновыми кислотами и специфическими белками, связывающимися с ними в процессе осуществления своих функций (полимераза.мп, нуклеазами, гистонами, регуляторными белками), а также между самими нуклеиновыми кислотами-матрицами и продуктами их транскрипции. Наконец, многие малые молекулы (витамины, жирные кнслоты и др.) специфически связываются со специальными транспортными белками. [c.339]

Белки-рецепторы могут служить лигандами для связывания гормонов п других низкомолекулярных эффекторов, транспортные белкп плазмы и белки-переносчики клеточных мембран — для связывания и очистки своих низкомолекулярных партнеров. Белки-регуляторы и участники процессов матричного синтеза, используемые в качестве лигандов, позволяют решать задачи по вычленению регуляторных участков нуклеиновых матриц и выявлению других компонентов синтезирующих систем. То же самое относится к системам выработки и транспорта энергии. [c.362]

Смит II соавторы с помощью аффинной хроматографии очищали рецептор прогестерона человека. Содержание рецептора в матке составляет лишь 0,002% суммарного белка, и оп весьма лабилен. В качестве лиганда использовали 11-дезоксикортикостерон. Гормон сажали на Br N-активнрованную сефарозу 41 в виде конъюгата с бычьим сывороточным альбумином. Полученный таким образом аффинный сорбент инкубировали 18 ч с частично очищенным цитозолем матки, промывали 0,4 М КС1 и элюировали мкМ раствором меченного тритием прогестерона. Рецептор выходил в комплексе с гормоном. Операция обеспечивала очистку в 10 ООО раз. Вместе с предварительной 6-кратной очисткой цитозоля осаждением сульфатом аммония это позволило авторам получить гомогенный препарат рецептора [Smith et al., 1981). [c.434]

Хроматографические методы, в которых разделение компонентов смеси основано на различии в размерах, форме или суммарном заряде молекул, часто недостаточно эффективны для разделения смесей белков. В таких случаях может оказаться полезной аффинная хроматография [48]. Успех метода зависит от того, удастся ли найти вещество, которое будет специфически взаимодействовать с подлежащим очистке белком. Для фермента таким веществом может быть конкурентный ингибитор катализируемой этим ферментом реакции, а для участвующего в гормональной регуляции белка-рецептора — соответствующий гормон. Это вещество связывают с подходящим нерастворимым гидрофильным носителем, и полученный материал используют при хроматографии как стационарную фазу. Вещества такого типа часто сами оказываются большими природными макромолекулами, и приемы, используемые для соединения их с носителями, сходны с методами приготовления иммобилизованных ферментов [см. разд. 27.4.2 (5)]. Реакции, с помощью которых белки, содержащие аминогруппы или фенольные группировки, могут быть связаны с носителем на основе сшитого полиакриламида, содержащего некоторое число гидразидных или 4-аминоанилидных остатков (схемы 30, 31 Б — остаток белка). Хорошие результаты получены в тех случаях, [c.322]

Хроматографию по сродству обычно применяют для очистки одногр компонента системы, состоящей из двух или более взаимодействующих веществ. Основной принцип заключается в прикреплении одного компонента к нерастворимой пористой матрице (иммобилизация). Связанный компонент (лиганд) может быть использован для специфической сорбции другого компонента в условиях, благоприятных для их взаимодействия и образования комплекса. Элюция сорбированного вещества может включать любую процедуру, ведущую к диссоциации. комплекса. Для очистки ферментов чаще всего используют конкурентные ингибиторы, связанные с носителями. В качестве лигандов могут быть взяты также кофакторы, субстраты ли фрагменты субстратов. В иммунологии хроматографию по сродству широко применяют для очистки антител на связанных антигенах и для выделения антигенов на связанных антителах. Метод с успехом используют для выделения белков-рецепторов, связывающих витамины и гормоны. ХрО матографию по сродству примедяют также для концентрирования разбавленных белковух растворов, удаления денатурированных или модифицированных ферментов из активных препара- [c.215]

В настощее время в виде очищенных индивидуальных белков получены рецепторы стероидных гормонов (прогестинов, глюкокортикоидов и половых гормонов) и холинергический рецептор никотинового типа. Успех в выделении холинергического рецептора в значительной степени определился удачным выбором объекта. Было обнаружено, что концентрация этих рецепторов в электрическом органе ската Torpedo или угря Ele trop-horus в сотни раз выше, чем во всех других исследованных тканях и объектах. В электрическом органе тысячи мембран соединены параллельно в одну батарею , в результате чего изменение потенциала на каждой из мембран, возникающее под действием ацетилхолина И составляющее десятки милливольт, суммируется и дает на выходе потенциал, равный киловольту. Эти мембраны буквально насыщены холинергическими рецепторами. Из 1 кг электрического органа можно выделить сотни миллиграммов гомогенного препарата холинергического рецептора. Для получения индивидуального белка достаточна его очистка всего в сто раз. [c.143]

Для того чтобы получить рецепторы стероидных гормонов в гомогенном виде, нужна их очистка в 10 000 раз (напомним, что для мембранных рецепторов. — более чем в 100 000 раз, см, раздел 3.3). Некоторые из этих рецепторов уже получены в чрстом виде. Показано, что они представляют собой асимметричные белковые молекулы, построенные из полипептидных цепей с молекулярным весом от 12 000 до 60 000, На свойства рецепторов не влияют нуклеазы, липазы и нейрамиь ндазы. Рецепторы, по-видимому, не обладают ферментативными активностями. Путем протеолиза молекулярный вёс р-ецепторов можно, снизить в. 10 раз. [c.208]

Лучшим доказательством огромных возможностей данного метода является постоянное увеличение числа ферментов и других белков, очистку которых проводят методом аффинной хроматографии. Характерно, что в число таких ферментов входят и некоторые аллостерические ферменты, такие, например, как глутаминсинтетаза. Кроме того, аффинная хроматография применяется для очистки антител, антигенов и нуклеиновых кислот. Одной из важнейших областей применения метода становится изучение гормонов и рецепторов лекарственных веществ, а также сложных клеточных структур, анализ которых до настоящего времени был в значительной степени затруднен. [c.104]