Аффинные лиганды использование

Хотя синтез аффинного сорбента с индивидуальной специфичностью при наличии одной из продажных активированных матриц и не представляет особого труда, он все же требует наличия достаточного количества очищенного аффинного лиганда, не инактивирующегося в условиях его посадки на матрицу. Заметим, что после посадки лиганда на матрицу прочность связывания с ним биоспецифического партнера может сильно уменьшиться по сравнению с тем уровнем, который наблюдался при образовании их свободного комплекса в растворе (иной раз константа диссоциации комплекса на сорбенте может оказаться на три порядка выше, чем в растворе). Это обстоятельство играет важную роль при осуществлении конкурентной аффинной элюции вещества с сорбента с использованием свободного лиганда (см. ниже). Тем не менее прочность аффинного связывания в большинстве случаев оказывается достаточной для удержания нужного вещества на матрице в условиях отмывки с нее всех сопутствующих ему примесей. Нередко прочность комплекса вещества с аффинным лигандом увеличивается, если последний имеет некоторую свободу ориентирования в пространстве, т. е. закреплен на матрице с помощью спейсера. [c.362]

Однако кажущаяся простота метода и отсутствие у новичка представления о возможных трудностях, сопровождающих его применение на практике, могут привести к обескураживающим неудачам. Действительно, трудно заранее предугадать, какой аффинный лиганд полезнее выбрать — с высоким или низким сродством, какова наиболее благоприятная концентрация этого лиганда в сорбенте, какую роль должна играть матрица, какие носители подходят и какие не подходят для иммобилизации аффинного лиганда. Например, отлично зарекомендовавшие себя с точки зрения иммобилизации ферментов носители на основе кремнезема оказываются в ряде случаев совершенно непригодными для использования в аффинной хроматографии из-за высокой неспецифической сорбции. [c.5]

Для аффинной хроматографии глико протеинов в качестве аффинных лигандов используются антитела или лектины. Использование антител как аффинных лигандов рассмотрено в разд. 6.3. Выделение гликопротеинов с помощью иммобилизованных лек- [c.118]

Количество связанного лиганда определяется в зависимости от его природы с помощью методов, основанных, как правило, на освобождении аффинного лиганда в результате щелочного или кислотного гидролиза. Анализируя пептиды, удобнее всего определять количество аминокислот после кислотного гидролиза [3]. При использовании радиоактивного лиганда целесообразно проводить измерение радиоактивности. Концентрацию связанного аффинного лиганда удобнее выражать числом микромолей этого лиганда, приходящимся на 1 мл набухшего в колонке геля, а не на 1 г сухого носителя. [c.12]

Количество исследований, в которых в качестве нерастворимого носителя применяется агароза и ее производные с привитыми аффинными лигандами, увеличивается по мере развития аффинной хроматографии, и полный обзор таких работ в рамках одной главы практически невозможен. Так, в 1968 г. были опубликованы всего две работы, описывающие использование агарозы в качестве носителя в аффинной хроматографии, в 1969 г. таких работ было уже примерно 10, а в 1970 г. — около 20, а в 1971 г. — более 40, в 1972 г. — более 70, а в последующие годы это число было вновь превышено. В табл. 7.3 приведены некоторые примеры использования агарозы в аффинной хроматографии, показывающие возможности этого метода. [c.38]

Обратная ситуация, когда лигандами служат ферменты, может встретиться при решении задачи выделения и очистки их субстратов и других компонентов ферментативной системы. Использование в качестве аффинных партнеров пары субстрат—фермент, разумеется, предполагает такие условия эксперимента, когда фермент не может осуществить каталитический акт преобразования субстрата, а только связывается с ним в комплекс, например в условиях отсутствия второго субстрата, необходимых ионов, прп неблагоприятном значении pH и т. д. [c.361]

Использование остатка фенилборной кислоты в качестве лиганда для аффинной хроматографии молекул, содержащих свободную цис-диольную группу рибозы, в последнее время приобретает все большую популярность. Два гидроксила фенилборной кислоты охотно взаимодействуют с г/мс-диольной группой, образуя комплекс по следующей схеме [c.373]

В этот обзор включены также аффинные лиганды с очень узкой специфичностью. Например, если к носителю прикрепить ингибитор, специфичный для единственного фермента, образующийся сорбент также будет специфичен только для данного фермента. Однако для использования специфических лигандов необходимо проводить различные и часто очень трудоемкие синтезы сорбента для каждого разделения. Не все аффинанты, которые подходят для комплементарного связывания макромолекул, имеют также подходящие функциональные группы для их прикрепления к нерастворимому носителю. Эти группы долл ны быть предварительно введены в аффинный лиганд, так же как и подходящей длины пространственная ножка , необходихмая главным образом для низкомолекулярных аффинных лигандов (она позволяет осуществлять их специфические взаимодействия с сорбируемым веществом). Практическая полезность специфических сорбентов возрастает, если для их приготовления вместо узко специфических лигандов использо-вать так называемый общий лиганд [37]. Очевидно, что матрица с групповой специфичностью, содержащая общий лиганд, проявляет аффинность к большой группе биологических макромолекул. Например, ферменты метаболизма аспарагиновой кислоты обнаруживают групповую специфическую [c.104]

Как это детально показано в разд. 6.3, антитела проявляют высокое сродство соответствующим антигенам и наоборот. Трудности их освобождения из комплексов 0бусл0 Влены именно этим сильным взаимодействием. Использования сильных хаотропных элюентов в иммуноаффинной хроматографии можно избежать путем химической модификации иммобилизованных аффинных лигандов [39]. Например, элюирование антиглюкагоновых антител из колонки с иммобилизованным глюкагоном может быть осуществлено в мягких условиях, если частично нарушить пространственную комплементарность к связывающему участку антитела путем избирательной модификации гормона, например реакцией с 2-окси-5-нитробензилбромидом, тетранитрометаном или перекисью водорода. [c.107]

Например, для того чтобы снять авидин с биоцитин — сефарозы, использовали 6 М гуанидинхлорид в солянокислом растворе (pH 1,5) [10]. В табл. 11.1 приведены и другие примеры выделения связывающих и транспортных белков с использованием аффинных лигандов. [c.124]

Развитие аффинной хроматографии сопровождается увеличением количества продажных иммобилизованных аффинных лигандов. Для составления общей картины о применении некоторых веществ в практике аффинной хроматографии в табл. 11.1 перечислены промыптленные названия носителей и иммобилизованных аффинных лигандов. Из цитированной в таблице литературы очевидно, что в настоящее время очень возросло применение продажных п.ммобилизованных аффинных лигандов, например конканавалина А, связанного с сефарозой ( кон А — сефароза). Можно полагать, что то же ожидает и другие хроматографические материалы. Точно так же как сегодня в очень редких лабораториях готовят ДЭАЭ- и КМ-целлюлозу, совершенно закономерно, что будет постепенно увеличиваться использование продажных био-специфических сорбентов. Это справедливо прежде всего для сорбентов с групповой специфичностью или сорбентов специфических к веществам, постоянно получаемым в лабораториях, и обусловлено специфической природой аффинной хроматографии. Из разнообразия биологически активных веществ следует, что необходим очень широкий ассортимент специфических сорбентов поэтому много научных работников, по-видимому, будут вынуждены сами готовить специальные высокоэффективные сорбенты. [c.137]

Избирательное выделение биологически активных макромолекул аффинной хроматографией основано на обратимых взаимодействиях между имхмо билизованным аффинным лигандом и свободной макромолекулой. Однако принцип аффинной хроматографии может быть также использован даже с сорбентом, который содержит необратимый ингибитор, когда после сорбции комплементарной макромолекулы в специфическом комплексе образуется ковалентная связь. Для освобождения выделяемого вещества из комплекса с аффинным сор бентом используют подходящую химическую реакцию. Пример ковалентной аффинной хроматографии— выделение ацетилхолинэстеразы с помощью иммобилизованных органофосфатов [1, 56]. Ацетилхолинэстераза принадлежит сериновым эстеразам, для которых типично ингибирование связыванием с органофосфатами или органофосфонатными эфирами, содержащими легко отщепляемую группу, например, [c.158]

Обзор связанных аффинных лигандов, иреимущественно белковой природы, на целлюлозе п ее производных сделан Сильма-ном и Качальским [67], обзор связывания ферментов — Круком и сотр. [11], а связывания нуклеотидов, полинуклеотидов и нуклеиновых кислот — Гиламом [22]. В этих обзорах упомянуто много различных методов связывания. Поскольку в настоящее время целлюлоза находит ограниченное использование в аффинной хроматографии, здесь кратко отмечаются только некоторые из методов связывания. [c.178]

Присоединение аффинных лигандов к декстрановым гелям может быть осуществлено с помощью ряда методов, описанных для целлюлозы, а также агарозы (см. ниже), а именно связывание после активации бромцианом, триазиновый метод, связывание с использованием эпоксидов или бифункциональных производных или связывание через ацилазидные промежуточные соединения. [c.183]

Реакция протекает ib метиловом спирте и воде при 25°С, и образующееся алкиламиностекло может быть использовано для иммобилизации аффинных лигандов и ферментов. Аффинные лиганды могут быть связаны с аминогруппами производных стекла своими карбоксильными группами при использовании раствори- [c.208]

В работе Олсона и др. [1] при разделении ферментов и антигенов аффинной хроматографией. применялись методы высокоэффективной жидкостной хроматографии, которую отличают использование небольших колонок, высоких скоростей разделения, связанных с этим высоких давлений в системе и, что наиболее существенно, относительно небольших количеств анализируемых веществ. Носителем для иммобилизации аффинных лигандов служил силикагель, поскольку получаемые аффинные сорбенты на этом носителе могут работать в условиях высокого давления. Наиболее ярким примером эффективности такого метода служит разделение в течение 5 мин Н4 и М4 изозимов лактатдегидрогеназы на колонке с №-(6-аминогексил)-АМР—силикагелем в градиенте NADH. [c.452]

При изучении взаимодействий белок — лиганд методом аффинной хроматографии концентрация белка ша составляет обычно <20 мкмоль (для белка с молекулярной массой 5000— 1 мг/мл). Соответственно для исследований, требующих более милимолярной суммарной концентрации лиганда, использование ms вместо ms в выражениях, приведенных в табл. 1 ji 2, не приводит к ошибке, поскольку соблюдается требование > 7гл. Однако, если ms и тл имеют сравнимые значения, необходимо различать параметры fus и ms и использовать последний параметр для количественной оценки аффинной хроматографии. [c.202]

К матрице аффинного сорбента, помимо общих для всех хроматографических матриц требований (нерастворимость п гидрофильпость, жесткость, подходящая форма и размер гранул, химическая стабильность в условиях модификации и в самом хроматографическом процессе, отсутствие неспецифической адсорбцип ж др.), предъявляется требование наличия химических групп, позволяющих с помощью несложной химической реакции ковалеитио связывать с матрицей разнообразные биологические молекулы (лиганды и спейсе-ры). Наиболее удобными с этой точки зрения оказались гидроксильные группы полисахаридных матриц — агарозы и сефадексов, а также амидные группировки полиакриламидного геля. Если иметь в виду аффинную хроматографию белков или использование белко- [c.342]

Использование белков-антигенов в качестве лигандов для очистки специфических антител на иммуносорбентах было описано в предыдущей книге этой серии [Остерман, 1983]. Там же была рассмотрена возможность связывания любых антител на матрице, несущей белок А из Staphylo o us aureus. Обе эти системы с полным правол можно включить в перечень аффинных хроматографических систем. Естественно, что иммуносорбенты используются и в обратном варианте, когда с помощью лигандов-антител производится очистка антигенов белковой природы пли гаптенов. [c.362]

Аффинный сорбент с групповой специфичностью пмеет явное преимущество в том случае, когда ставится задача не только очистки, но и разделения нескольких веществ, наделенных сродством к одному и тому же лиганду. Если степень этого сродства не одинакова для разных веществ группы или если удается подобрать для них различные (специфические) конкурентные элюенты, то разделение веществ люжет быть осуществлено хроматографически, в ходе пх поочередной элюции с сорбента, что не удалось бы сделать в случае лиганда, обладающего сугубо индивидуальной специфичностью. С позиций очистки одного вещества это же положение дел можно сформулировать следующим образом снижение избирательности сорбции ири использовании сорбентов с групповой специфичностью часто удается компенсировать за счет избирательности аффинной конкурентной элюции. [c.363]

Не удивительно поэтому, что популярность и сфера применения аффинных сорбентов с групповой специфичностью в последние годы быстро увеличиваются, а вместе с ними растет и список таких сорбентов, поставляемых в готовом виде. Нам необходимо познаколгать-ся с торговылш наименованиями, особенностями и областями использования важнейших из них. Не будем загромождать изложение их техническими характеристиками (емкость, пористость, рабочий диапазон pH). Иногда эти параметры будут очерчиваться самой сферой применения сорбентов во всяком случае, их нетрудно найти в каталогах фирл1, которые мы упомянем. Рубрикация дальнейшего изложения построена по наименованиям самих лигандов. [c.363]

Кислый аминополисахарид гепарин [М> 10 ООО) известен в качестве антикоагулянта крови. Кроме того, он применяется в биохимии как ингибитор рибонуклеаз. Это его качество, по-видимому-отражает некоторое сходство полимера, содержащего две-три суль, фогруппы на каждую дисахаридную структурную единицу, с РНК-Две эти особенности определили использование гепарина в качеств, лиганда для аффинной хроматографии факторов коагуляции крове и (особенно широко) для очистки белков, взаимодействующих и нуклеиновыми кислотами (полимераз, обратной транскриптазы, рес стриктаз, факторов инициации и элонгации белкового синтеза и др.). Кроме того, иммобилизованный гепарин связывает липопротеид-липазы и некоторые липопротеиды. Гепарин-агароза выпускается всеми упомянутыми фирмами-поставщиками аффинных сорбентов, кроме Bio-Rad . [c.370]

Теперь можно вернуться к процедуре посадки лиганда на матрицу. После окончания инкубации необходимо блокировать не использованные в реакции с лигандом активные группы матрицы. Для этого сорбент переносят в 1 М раствор этанола.мина или 0,2 М раствор глицина при pH 8 и снова перемешивают, как при посадке лиганда. Наконец, для удаления избытков лиганда и блокирующих агентов гель промывают на воронке 4—5 раз попеременно кислым и щелочным буферами, например 0,1 М Na-ацетатным (pH 4) и буфером. используемым для посадки лиганда, добавляя в оба буфера до 0,5 М Na l. Чередование pH при промывке способствует десорбции неспецифическп сорбированного на матрице материала. Промытый аффинный сорбент переводят в буфер для хроматографии и хранят на холоду. [c.377]

Эти соображения в определенно степен сохраняют свою силу и при использовании низкомолекулярных лигандов, если в ходе аффинной хроматографии на них будут сорбироваться белки. Разумеется, ситуация здесь лучше, так как на поверхности белка может быть лишь небольшое число аффинных центров связывания, а действующие здесь силы уступают ковалентным связям, поэтому денатурации белка при посадке на аффинный сорбент опасаться не приходится (мы сейчас оставляем в стороне возможность связыва- [c.386]

Как уже упоминалось, ПК в качестве лигандов могут обладать как групповой специфичностью (для белков хроматина, факторов управления трансляцией, нуклеаз и др.), так и индивидуальной (для индивидуальных мРНК, белков-регуляторов транскрипции и др.). Во втором случае на аффинном сорбенте должны быть закреплены вполне определенные участки генома. Это стало возмолшым после создания способов отбора и наработки в достаточных количествах строго идентичных фрагментов ДНК методами генной инженерии. В последнее время возникла еще одна область использования иммобилизованных НК — в качестве праймеров матричного синтеза. Эти приложения предъявляют разные требования к характеру фиксации НК на матрице. В первом случае расположение точек закрепления на молекуле НК может быть произвольным, во втором определенные и достаточно протяженные участки полинуклеотидной цепи должны быть свободны для комплементарного взаимодействия, а в третьем закрепление НК на матрице желательно осуществить лишь по одному определенному концу молекулы. Что же касается возможности реакций с активированными матрицами, то вдоль всей молекулы НК во множестве располагаются химически эквивалентные группы аминогруппы нуклеиновых оснований, гидроксилы сахаров и др. В особом положении находится только концевой остаток фосфорной кислоты или сахара. [c.387]

Отсюда следует важный практический вывод для полноты связывания необходимо выполнение условия [L] К . При выборе концентрации лиганда в сорбенте надо опираться на значение константы диссоциации аффинного комплекса. Здесь следует проявлять осторожность в отнотиении использования значений Къ, известных из взаимодействия аффинных пар в растворе их сродство на сорбенте, как уже упоминалось, может быть слабее, а значение — соответственно больше. Тем не менее для оценки порядка величии эти цифры использовать можно. [c.400]

Смотреть страницы где упоминается термин Аффинные лиганды использование: [c.452] [c.201] [c.13] [c.18] [c.70] [c.116] [c.123] [c.141] [c.143] [c.211] [c.219] [c.220] [c.236] [c.8] [c.11] [c.13] [c.19] [c.90] [c.342] [c.344] [c.357] [c.368] [c.370] [c.402] [c.405]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология