Био-гель электрофокусирование

Для приготовления 2 мл геля, достаточного для заполнения одной трубки при электрофокусировании, смешивают 0,4 мл раствора № 1, [c.100]

Электрофокусирование. В отличие от описанных методов, при которых работают с постоянным pH, здесь электрофорез осуществляется в градиенте pH на основе амфотерных молекул (коммерческие препараты) или уже фиксированных (иммобилизованных), добавляемых в акриламидный гель. В этих условиях белки мигрируют до тех пор, пока не достигнут зоны pH геля, которая соответствует их изоэлектрической точке рН1 (или в этом случае их суммарный заряд равен нулю). Каждая из фракций фокусируется в очень тонкие полосы, что обеспечивает разрешение, обычно недостижимое при других методах. [c.40]

В настоящей главе рассматривается применение электрофокусирования на синтетических амфолитах-носителях, приводятся основные сведения о методе, даются подробные указания относительно фракционирования белков на препаративном уровне при стабилизации градиента pH с помощью градиента плотности, приводится описание аналитического фракционирования в полиакриламидном геле [c.297]

Рис. 8. Схема прибора для электрофокусирования в столбике геля.

В основном эта методика соответствует обычной прописи для диск-электрофореза, детально описанной Дэвисом [99]. Однако подготовка для электрофокусирования осуществляется несколько проще и быстрее. Для достижения хорошего разрешения нет необходимости готовить несколько слоев геля и формировать плоскую поверхность столбика. [c.324]

Закрывают нижний конец трубки и заполняют ее указанным выше раствором, не доходя 5 мм до края. Сверху тонко оттянутой пипеткой наносят слой воды толщиной 3 мм. При химической полимеризации гель застывает через 20—30 мин после приготовления рабочего раствора (20—25°С). Для фотополимеризации необходима экспозиция при сильном освещении в течение 30 мин. В том и в другом случае скорость полимеризации можно снизить, охлаждая рабочий раствор. Перед заполнением трубок рабочий раствор нужно дегазировать, для этого его выдерживают в вакууме при осторожном встряхивании. Эта мера позволяет избежать появления пузырьков в геле во время электрофокусирования. [c.325]

Ряд вопросов постановки эксперимента при электрофокусировании в градиенте плотности, такие, как выбор температуры, концентрации и рН-диапазона амфолитов-носителей, сохраняют свое значение и при электрофокусировании в геле. Другие аспекты, свойственные только этому методу, требуют специального разбора. [c.327]

Почти во всех работах по электрофокусированию в геле применяется полиакриламидный гель (табл. 2). Этот гель предпочитают другим средам, так как в области pH 3—10 он содержит мало заряженных групп, а также обладает низким электроэндоосмосом (1—2 см за 16 ч при электрофокусировании в блоке [89]). Несмотря на медленное смещение градиента pH в направлении катода [87, 92], этот гель достаточно устойчив в течение эксперимента. [c.328]

На рис. 12 приведен пример постепенного фокусирования сложной смеси белков, нанесенной на столбик геля с предварительно фокусированными амфолитами с диапазоном pH 3—10. Электрофокусирование завершается примерно через 50 минут, но спектр разделения фактически остается неизменным при бодее длительном электролизе. Для сравнения отметим, что фокусирование того же образца в более узком диапазоне pH, например 5—8, занимает 75 мин. [c.330]

Рие. 16. Электрофокусирование в геле амфотерных красителей [c.335]

Сочетание методов электрофокусирования и электрофореза в геле [c.337]

Сочетание электрофореза и электрофокусирования в геле оказалось в ряде случаев удобным методом двумерного анализа белка. Множество компонентов, присутствующих в сыворотке крови, не могут быть однозначно идентифицированы каким-либо одним методом. Их вначале разделяют электрофокусированием в столбике геля, а затем электрофорезом в перпендикулярном направлении в блоке геля [86, 88, 91]. Полученная таким путем двумерная карта (рис. 17) используется при диагностике заболеваний. Этот метод, называемый также методом белковых [c.337]

На рис. 18 приведен другой пример Двумерного анализа. Электрофорезом или электрофокусированием в геле белки [c.339]

Качество фракционирования можно повысить путем одновременного или последовательного применения нескольких указанных выше принципов электрофореза. Так, например, на первом этапе разделения используют электрофокусирование в геле, а на втором — электрофорез в среде, обладающей свойствами молекулярного сита. Можно также провести на первом этапе электрофорез в среде с постоянным значением pH, а на втором — электрофорез в присутствии анионного детергента и т. п. (см. гл. II.3). [c.216]

Для анализа антигенов, разделенных с помощью электрофореза или электрофокусирования в полиакриламидном геле, разработаны многочисленные методы иммунодиффузии. Так, для этой цели можно использовать различные варианты двойной иммунодиффузии. Цилиндрические столбики геля разрезают продольно на две половинки (см. разд. 1.15.6), а из пластин нарезают полоски, содержащие разделенные антигены. Разрезанный гель помещают на стеклянные пластинки, заливают их теплым раствором агара и дают ему застыть. Канавки для антител располагают на соответствующем расстоянии от полиакриламидного геля. Как только полиакриламидный гель покроется слоем агара толщиной 1 мм, в непосредственной близости от него сразу же вырезают канавку для антисыворотки. Если для анализа используют разрезанные вдоль столбики полиакриламидного геля, то их кладут на слой агарового геля и в нем рядом с полоской геля по обеим ее сторонам быстро вырезают канавки для антител. Преципитаты образуются под полоской полиакриламидного геля. Столбик полиакриламидного геля можно также разрезать в поперечном направлении на диски и проанализировать присутствующие в них антигены методом двойной радиальной диффузии 203, 394]. [c.244]

Гель-электрофокусирование является модификацией изоэлект-рического фокусирования и применяется преимущественно для микроанализа белков. Сахарозную среду заменяют полиакриламидным гелем, а разделение занимает всего 1—3 ч. [c.135]

ТСГФ удобно использовать в качестве экономного пробного метода для выбора типа геля и скорости элюции при подготовке препаративной очистки белка гель-фильтрацией на колонке. Малое количество необходимого препарата и возможность одновременного обследования нескольких препаратов делает метод ТСГФ привлекательным и для клиники, где он может дополнить, а иногда и заменить электрофорез и электрофокусирование. [c.165]

После окончания электрофокусирования гели извлекают из трубок. Часть гелей прокрашивают для выявления белковых зон, а один или два геля используют для измерения градиента pH, сформированного в ходе изоэлектрофокусирования. Существует много вариантов окраски гелей. Один из них состоит в том, что гели погружают на 1 ч в 0,075%-ный раствор кумасси (7-250 в 3,5%-ном растворе НСЮ4. Затем гели 3— [c.101]

Изоэлектрическое фокусирование [42 — 45] в линейном градиенте pH позволяет разделить белки, характеризующиеся различными изоэлектрическими точками. Для создания градиента используют носители с цвнттер-ионными свойствами — алифатические полиаминополикарбоновые кислоты, имеющие М 200 — 700. При движении в градиенте pH суммарный заряд белка постоянно меняется, и в области pH, близких к изоэлектрической точке, становится равным нулю. Соответствующий белок фокусируется , образуя узкую зону. При препаративном фокусировании в колонке стабилизация градиента pH осуществляется с помощью градиента плотности используемого буферного раствора, однако чаще работают с плоскими слоями полиакриламидного или гранулированного геля. Опубликовано краткое сообщение о непрерьтном электрофокусировании без носителя [46]. Эффективность электрофокусирования высока. Так, возможно, например, разделить белки, различающиеся по ИЭТ лишь на 0,01 единицы pH. При разделении сыворотки образуется более 40 белковых полос. [c.351]

Для контроля за степенью очистки белков чаще применяют метод электрофореза. Большинство авторов в качестве носителя используют гомогенные гели или градиент концентрации акриламида. Основной способ при этом — электрофорез в диссоциирующей среде ДДС-Na соответственно процедуре, которую описал Лэммли [68]. В определенных случаях завершающим приемом при этом являются иммунодиффузия [29, 114] либо иммуноэлектрофорез [17, 80, 118]. При исследовании структуры некоторые авторы прибегают к двумерному электрофорезу. Тогда первая миграция молекул может происходить в гомогенном геле полиакриламида с ДДС-Na или без него во втором направлении молекулы мигрируют в полиакриламидном геле с ДДС-Na в присутствии восстановителей дисульфидных связей (р-меркапто-этанол) [10, 40, 61, 78]. Чтобы охарактеризовать субъединицы легуминов гороха и конских бобов, Матта и др. [77, 78] применяют сочетание ДДС-Na с р-меркаптоэнталом и электрофокусированием. Рестани и др. [92 пользуются этим же способом применительно к глобулинам люпина, а Ху и Еэзен [53] демонстрировали гетерогенность белков сои. Указанные методы с [c.155]

Между тем все выделенные фракции невосстановленных белков имеют сложный состав. Фракционирование единиц глютенинов после восстановления дисульфидных связей алкилирования позволяет отделить более простые фракции. Для этого в основном применяют методы электрофореза ДДС-Na-nAAF, электрофокусирование, ДДС-Na-nAAr совместно с электрофокусировкой [20, 92, 108], но с определенным успехом использовали также гель-фильтрацию и ионообменную хроматографию. [c.200]

Аминокислота Выделенные с помощью ДДС-Ыа-ПААГ 57] Выделенные гель-фильтра-цией и изоэлек-трофокусирова-ние.м Выделенные гель-фильтрацией. ионообмен ной хроматографией и изо электрофокусированием Субъединица агрегированного глиадина 11671 [c.207]

На рис. 8 приведена схема прибора для диск-электрофо-реза, подготовленного для электрофокусирования в геле. Находящийся в трубках полиакриламидный гель содержит амфолиты-носители, которые вместе с образцом равномерно распределены по всему гелю или наслоены сверху. Для предотвращения окисления или восстановления амфолитов-носителей (на аноде и катоде соответственно) электроды погружают в раствор кислоты или основания. Во время электролиза кислота благодаря отрицательному заряду сульфат-иона остается в анодном отделении. В кислой среде над слоем геля амфолиты-носители приобретают положительный заряд и вследствие этого стремятся к кётоду. При подаче постоянного напряжения амфолиты распределяются по трубке в порядке их изоточек и фокусируют ам-фолиТы-Образцы в областях, соответствующих их изоточкам. Напротив, в основной среде вблизи катода амфолиты заряжены отрицательно и вследствие этого движутся к аноду. После удаления из трубок гель можно анализировать любыми методами, позволяющими избежать влияния амфолитов-носителей. [c.321]

Рис. 9. Прибор для электрофокусирования в геле фирмы 8Ьап(1оп . Прибор снабжен дополнительной насадкой, позволяющей увеличить размеры верхней камеры для работы с трубками длиной 110 мм (см. разд. 8.3.4.8).

О появлении множества ложных зон при электрофокусировании гемоглобина в геле с персульфатом калия сообщает Ригли [4]. В этом случае появления артефактов не удается избежать даже предварительным электрофорезом в течение 80 мин. Этот факт говорит о том, что при наличии в геле персульфата предварительный электролиз, возможно, является недостаточной мерой. Поэтому рекомендуется всякий раз, когда это возможно, получать гель фотополимеризацией. [c.328]

Величина пор выбирается таким образом, чтобы гель не слишком ограничивал фокусирование зон. При этом необходимо, с одной стороны, обеспечить достаточную прочность геля и, с другой стороны, свободную миграцию белков с молекулярным весом примерно до 100000. Удовлетворительным в этом отношении является 7,5%-ный гель. Для более крупных белков необходимо применять менее концентрированный гель, в случае необходимости его укрепляют включением агарозы [111, 112]. Сама агароза оказалась удобной средой для электрофокусирования в геле, предшеств щего иммунодиффузии [78, 84]. [c.328]

Электрофокусирование образца, нанесенного в виде узкой зоны, осуществляется быстрее по сравнению с образцом, распределенным по всему, гелю (для овадьбумина й гемоглобина это время составляет 20 мин и около 45 мин соЬт йтствёнйо). [c.330]

Популярность метода электрофореза в геле привела к созда нию методов специфического обнаружения и количественной оценки в геле белков, гликопротеинов, липопротеинов, нуклео-протеидов и многих ферментов [113, 114]. Все эти методы могут применяться и при электрофокусировании в геле при услови1 , что удалось избежать влияния амс олитов-носителей. При обнаружении некоторых ферментов может оказаться полезным [c.331]

Для обычного электрофореза и электрофокусирования в геле удобными являются трубки длиной 65 мм. Трубки большей длины не дают заметных преимуществ из-за возрастающей диффузии зон. Однако при элек- [c.332]

Благодаря высокому разрешению электрофокусирование в геле можно использовать для препаративного выделения белков, элюируя компоненты с отдельных кусочков геля. Местоположение зон определяют по отношению к окрашенным маркерам, окрашиванием отдельных полосок геля (при работе в блоке) или измерением pH на поверхности геля с помощью стеклянного микроэлектрода (см. разд. 8.3.3.5). Однако извлечение белка с геля является довольно сложным, поэтому таким методом можно приготовить лишь незначительные количества вещества. Либек и Руттер [89] описали другой метод препаративного разделения в геле, позволяющий работать с 30 мг белка. В этом случае образец наносят в щель на блоке геля. После фокусирования компонент увлекается эндоосмосом во вторую щель, откуда вымывается поперечным потоком элюента. [c.336]

Первое направление электрофокусирование 1 мг белка в столбике геля (5 ПО мм), 4 ч. 600 В, pH 5 (слева)—9. Второе направление электрофорез в крахмале, буферный раствор —алюминийлактат, pH 3,2. [c.339]

Неоднократно с помощью электрофокусирования в градиенте плотности или в геле удавалось обнаружить ббльшую степень гетерогенности по сравнению с тем4 что было известно ранее [c.339]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология