Амфолины

Изоэлектрофокусирование — один из вариантов электрофоретического разделения макромолекул. Принцип метода состоит в следующем. Если на колонку, вдоль длины которой сформирован градиент pH, нанести образец белка, а потом подключить концы колонки к источнику тока, то молекулы белка будут двигаться по колонке до тех пор, пока не достигнут той области, где величина pH окажется равной величине изоэлектрической точки белка. Для создания градиента pH используются сложные смеси амфотерных соединений, по-разному обозначаемые фирмами-изготовителями (например, амфолины, фармалиты, сервали-ты и т. д.). Эти соединения обычно имеют небольшую молекулярную массу (400—800 Да) и получаются пууем химического синтеза. Общая формула некоторых типов амфолитов может быть представлена в виде [c.98]

Амфолиты следует добавлять в промытые гели после того, как последние станут прозрачными. Робинсон нашел, что при нанесении амфолина на поверхность геля распределение получается неравномерным, что ведет к искажению градиента pH. Этого можно избежать, если предварительно полностью высушить гель и после этого вымочить его в 2 %-ном растворе амфолина. [c.173]

Ввиду высокой стоимости готового амфолина Виноградов и сотр. [395] исследовали возможность приготовления его в лаборатории и получили продукт, давший хорошие результаты в интервале pH от 4 до 8. Приготовлен этот амфолит был по следующей методике. [c.173]

Метод изоэлектрического фокусирования — один из наиболее эффективных и широко распространенных методов очистки и фракционирования белков. Он основан на том, что в изоэлектрическом состоянии белок теряет заряд и подвижность в электрическом поле. Трубку с гелем заполняют амфолинами, создающими фадиент pH. В электрическом поле белок будет передвигаться до того значения pH, [c.21]

Физико-химическая характеристика изоэнзимов. Так как выделенные нами две кислые изопероксидазы фокусируются на ПАГ-пластинках с амфолинами в очень узкой зоне pH, то последующая процедура их разделения на индивидуальные компоненты весьма затруднительна. Поэтому физико-химические характеристики были получены общие для этих [c.85]

Особенно часто применяются и детально исследованы амфо-литы-носители фирмы LKB (Швеция). Можно предположить, что основные выводы, полученные при изучении амфолина фирмы LKB, справедливы и для других типов амфолитов-носите-лей, если они удовлетворяют предъявляемым к ним требованиям. [c.129]

Описан еще один очень простой метод ИЭФ в геле [364]. В нем используют стеклянные трубочки длиной 150—200 мм с внутренним диаметром 0,3 см. Полиакриламидные гели (8% Т), содержащие 1 % амфолина, готовят с помощью фотополимеризации. Нижние концы трубочек опускают в маленькие сосуды, в которых находятся платиновые электроды и небольшой объем 1 %-ного этилендиамина. Пробы в 1%-ном растворе амфолина наносят поверх гелей, а над ними аккуратно наслаивают еще 0,5—1 мл 1 %-ного амфолина. В каждую трубочку вставляют платиновый электрод, погружая его в самый верхний слой раствора. [c.149]

Для извлечения белков после ИЭФ отдельные сегменты, содержавшие белковые полосы, вырезали из геля и тщательно отмывали от амфолина. Эти кусочки геля гомогенизировали с помощью стеклянного гомогенизатора в 12,5%- Ной ТХУ, которую затем удаляли путем последовательных промываний 50%-ным спиртом, абсолютным спиртом >и эфиром. Наконец, из высушенного эфиром геля 0,1 М муравьиной кислотой экстрагировали белки. При разделении методом ИЭФ радиоактивных протеолитических фрагментов гемоглобина выход полипептидов составлял 75%. Такая процедура приводит к денатурации разделенных белков, но она вполне пригодна в тех случаях, когда полученный материал предназначен для определения его аминокислотного состава. [c.151]

Окрашивание белков специфическими красителями осложняется при ИЭФ из-за присутствия амфолина, так как большинство таких красителей образует комплексы и с амфолита-ми-носителями. Поэтому необходимо использовать особые приемы окрашивания. [c.154]

ИЗОЭЛЕКТРОФОКУСИРОВАНИЕ, метод разделения и анализа амфотерных в-в, гл. обр. белков, в электрич. поле в среде с изменяющимся в определ. направлении pH. В-ва при зтом смещаются к катоду или аноду до тех пор, пока каждое из них не достигнет зоны, pH к-рой совпадает с его изоэлектрич. точкой, и не сконцентрируется в ней ( фокусирование ). Градиент pH создают, помещая в электрич. поле смесь амфолитов с широким набором изоэлектрич. точек, напр, смесь полиаминов, замещенных в разл. степени карбоксиалкильными группами (т. н. амфолинов). Для стабилизации градиента разделение проводят в вертикальных колонках с градиентом плотности, наполненных сахарозой или глицерином, либо в слоях гелей (полиакриламида, се-фадексов). Метод обладает высоким разрешением и примен. для выделения и очистки от десятков миллиграммов до неск. граммов белков, идентификации (неск. мкг) и анализа их сложных смесей и т. д. [c.216]

Для создания стабильного градиента pH используют специальные вещества, получившие название амфолинов. Это смесь коротких полимерных молекул, содержащих в различных соотношениях карбоксильные и аминогруппы. Иными словами, амфолинь — это смесь молекул амфотерных электролитов с разными значениями изоэлектрических точек. В постоянном электрическом поле они перемещаются в растворе или в геле до достижения зоны, в которой их суммарный заряд равен нулю, после чего до тех пор, пока приложено электрическое поле, они будут оставаться на месте. На этом участке они играют роль буферного компонента, поддерживающего стабильное значение pH. [c.244]

Наиболее трудных разделений последовательных зон с низким содержанием образца удается избежать путем добавления прокладочных соединений, в основном амфотерных [амфолин, фирмы LKB (Бромма, Швеция)], в подходящем узком диапазоне изоэлектрических точек. Свендсен [93] продемонстрировал возможность этого метода на примере разделения компонентов гемоглобина человека (см. рис. 12.31). [c.318]

Это гетерогенные синтетические материалы, выпускаемые фирмой LKB под названием амфолино-вые электролиты ( Ampholine ele trolyte ), с известным диапазоном р/. Амфолиновые электролиты представляют собой смесь алифатических полиаминополикарбоновых соединений с молекулярной массой 300—1000 и р/ от 3 до 10 диапазон р/ может быть и более узким. [c.319]

Аппарат фирмы LKB объемом 110 мл [104] линейный градиент концентрации сахарозы в 1%-ном растворе амфолина LKB, pH 5—8 в присутствии б М мочевины образец — 25 мг обессоленного препарата в 56 мл раствора, не содержащего сахарозы условия разделения 2 ч при 500 В и 48 ч при 800 В начальный ток 2,8 мА, конечный — 1,8 мА температура —20 °С, объем отбираемых фракций — примерно 30 капель. У — изоэлектри-ческие точки фракций с максимумом поглощения при 280 нм 2 —градиент pH. [c.322]

Одно из преимуществ тонкослойной изоэлектрической фокусировки — малый расход амфолитов-носителей. Это очень важное преимущество, так как поставляемый фирмами амфо-лит (амфолин) очень дорог. Он представляет собой синтетическую смесь низкомолекулярных полиаминокарбоновых кислот неизвестного состава. [c.173]

Левин [400] рекомендует перед нанесением пробы подвергать гель с амфолином предварительной электрофокусировке, чтобы повысить воспроизводимость и добиться более определенной интерпретации результатов. Целесообразно в одном пс-следовании пользоваться амфолином из одной и той же партии, поскольку оказалось, что разные партии амфолина дают несколько различное разделение [401]. При разных концентрациях амфолина из одной партии градиент pH также получается различным [392]. [c.174]

Авторы работы [426] удаляли амфолин двумя различными методами. По одной из методик фракции подвергали диализу в подходящем буферном растворе. После этого проводили обращенный диализ в растворе сульфата аммония для осаждения белка, который затем удаляли центрифугированием. В соответствии с другой методикой объем фракции вначале уменьшали с 3 до 2 мл ультрафильтрацией и после этого проводили диализ in situ в буферном растворе до тех пор, пока объем фракции не увеличивался в 2—3 раза. После этого объем снова уменьшали отгонкой при уменьшенном давлении до окончательного требуемого объема, величина которого зависела от концентрации белка. [c.178]

Однако методом изоэлектрофокусирования на ПАГ-пластинках, содержащих амфолины в диапазоне pH 3,5—9,5, определено 14 белков с пероксидазной активностью (рис. 9). Из них три катионных с изоэлектрическими точками — 9,4 8,7 и 8,0 пять изоэнзимов нейтральных и слабокислых — 7,0 6,7 6,5 6,3 и 5,9 остальные — кислые анионные белки с изоэлектрическими точками — 5,3 5,0 4,5 4,2 4,0 и 3,8. Итак, в составе изопероксидаз растений дурмана преобладают в основном кислые изоэнзимы фермента. Три быстро движущихся изоэнзима содержатся в наибольшей концентрации. Именно для этих пероксидаз из зараженных ХтВК растений интенсивность окраски и скорость проявления с различными субстратами идут всегда быстрее, чем в контроле [Андреева, Омельченко, 1985]. [c.68]

Различия в количестве изопероксидаз, полученные методом электрофореза (рис. 8) и при изоэлектрофокусировании (рис. 9), очевидно, происходят от того, что при электрофорезе некоторые изоэнзимы движутся в электрическом поле вместе и занимают одинаковое положение. Факты эти в литературе описаны. При изоэлектрофокусировании амфолины, входящие в состав геля, способствуют более четкому разделению белковых препаратов, удерживая белки в их изоэлектрических точках. [c.68]

Рис. 50. Общая формула амфолитов-носителей, выпускаемых фирмой LKB-Produ ter АВ (Стокгольм, Швеция) под торговым названием амфолины

Сначала амфолиты-носи-тели с выбранныьм диапазоном pH смешивают с растворами, используемыми для создания градиента плотности. При работе с амфолином фирмы LKB его конечная концентрация составляет обычно 1%. Для получения необходимого градиента плотности в о)писанном выше приборе в нижнюю часть колонки наливают 50%-ную (масса/объем) сахарозу, а в верхнюю1 7о Ную или чистый раствор амфолина. Это делают с помощью градиентного смесителя, а при его отсутствии наслаивают друг на друга растворы сахарозы с постепенно убывающей плотностью. Исследуемую пробу можно смешать с одним из таких слоев. При использовании смесителя ее добавляют либо к легкому, либо к тяжелому раствору сахарозы. Кроме того, пробу можно нанести поверх сформированного градиента. После этого электродные сосуды наполняют соответствующими растворами. В катодный сосуд наливают разбавленный раствор этанолами-на или другого сильного органического основания (в случае же сильно основных белков используют гидро ксид натрия), а в анодный сосуд — разбавленную серную или фосфорную кислоту. [c.132]

Был описан еще один очень простой метод ИЭФ [709]. Стеклянные трубки с внутренним диаметром 0,6 см и длиной 20 см закрывают снизу диализной мембраной, заполняют раствором с градиентом концентрации сахарозы (40—10%), содержащим 1% амфолина, и помещают в аппарат для диок-элект-рофореза. Фокусирование заканчивается через 5—6 ч, после чего на верхнюю часть каждой трубки надевают конический тефлоновый колпачок, через который полученные фракции вытесняются вверх в результате накачивания в трубку снизу какого-либо раствора с высокой плотностью. Естественно, что при использовании такой методики также мож1но одновременно изучать несколько различных препаратов. [c.135]

Рис. 55. Аппарат J-образной формы для одновременного изоэлектрического фокусирования нескольких образцов [444], А. Размеры трубок и приспособление, для фракционирования раствора с градиентом плотности после изоэлектрического фокусирования. Масштаб 5 мм = 1 см. Б. Расположение J-образных трубок во время опыта. 7 —трубочка с канюлей, соединяющая колонку с анализатором градиента плотности фирмы IS O 2—съемная воронка для собирания фракций 5— пришлифованные поверхности -i —анодный раствор с низкой плотностью 5 —электролит (H2SO4) 5— катодный раствор с высокой плотностью 7 —стержень для перемешивания жидкости на магнитной мешалке 5—верхний электродный сосуд Р —градиент плотности с амфолинами —нижний электродный сосуд.

Во многие прописи для приготовления пол иакриламидного геля для ИЭФ входит ТЕМЭД, однако без него вполне можно обойтись. Предполагают, что его роль выполняет смесь веществ, содержащихся в амфолине [868, 1098]. [c.148]

Изоэлектрическое фокусирование в пластинах полиакриламидного геля. Предложена методика проведения ИЭФ в тонком слое 5%-ного полиакриламидного геля, содержащего 2% амфолина [71]. Гель получают путем фотополимеризации в кювете, образованной двумя стеклянными пластинками, которые удерживаются на расстоянии 1 мм друг от друга с помощью прокладок из силиконовой трубки. Поверх ность одной из пластинок оиликонизируют. Всю конструкцию скрепляют большими пружинными зажимами для бумаги. По око1нчании полимеризации силиконизнрованную пластинку отделяют от геля, который остается прикрепленным ко второй пластинке. Для внесения пробы кусочек фильтровальной бумаги пропитывают определенным объемом исследуемого раствора и вставляют в щель, прорезанную в слое геля. Затем пластинку с гелем переносят в пластмассовую коробку и укладывают на два горизонтально расположенных угольных стержня, служащих электродами. Катод и анод смачивают 5%-ными растворами соответственно этилендиамина и фосфорной кислоты. На время опыта в коробку помещают насыщенную водой синтетическую губку для создания в камере влажной атмосферы. ИЭФ проводят в [c.149]

Для формирования геля применяют как фотополнмериза-цию, так и химическую полимеризацию, инициируемую персульфатом [749]. Во втором случае в гелеобразующие растворы амфолин не добавляют, полученный гель промывают несколькими порциями воды, а затем наносят на него слой 24%-ного раствора амфолина. [c.150]

Рис, 59. Сравнение градиентов pH и результатов изоэлектрического фокусирования белков в 7,5%-НОМ полиакриламидном геле, проведенного в макро- и микромас[нтабах [420]. Гели содержали амфолины фирмы LKB с pH в интервале 3—10. Кривая представляет собой градиент pH, полученный в макрогеле. Светлые кружки обозначают средние значения pH в каждом кусочке разрезанного микрогеля длиной 1 см, отложенные против расстояний от начала геля до середины каждого кусочка. Темные кружки указывают средние расстояния, пройденные стандартными белками при pH, соответствующих изоэлектрическим точкам. Линии, пересекающие темные кружки, отражают утроенную величину среднего стандартного отклоне,ния. Были использованы следующие белки (в порядке увеличения расстояния, пройденного ими от старта) а-ка-зеин, янчный альбумин, бычий сывороточный альбумин, гемоглобин, химотрип-син, а-химотрипсиноген А, рибонуклеаза. [c.153]

Хотя концентрация белков в зонах, разделившихся при ИЭФ в геле, и достигает значительного уровня, он не всегда достаточно высок для обнаружения белков путем их осажлте-ния. Поэтому в большинстве случаев приходится прибегать к более чувствительным методам окрашивания. Для преодоления трудностей, связанных с взаимодействием красителя и амфолина, имеются два пути. Первый путь — это удаление амфолитов-носителей после фиксации, но до окрашивания белков, а второй — подбор таких условий, при которых комплексы краситель — амфолин оказываются менее прочными, чем комплексы краситель — белок. Ниже будут рассмотрены некоторые приемы, позволяющие использовать обе эти возможности. [c.154]

Модификация этого метода описана в другой работе [478]. Гели погружают на 15 мнн в раствор, содержащий 0,5 г бромфенолового синего и 50 мг сулемы в 500 мл 50%-ного спирта. (Следует остерегаться попадания этого раствора на кожу ) Отмывание гелей производят в течение ночи в омеси этанол — вода — уксусная кислота (30 65 5 по объему). Отмытые гели хранят в 7,5%нной уксусной кислоте. Этим методом выявляются также и полосы амфолина, которые окрашиваются в желтый цвет, тогда как участки между ними становятся красноватыми. Недостаток метода окрашивания белков бромфеноловыад синим заключается в том, что он имеет более низкую чувствительность, чем методы с применением других красителей. [c.155]

Для одновременного окрашивания и фиксации белков в присутствии амфолина описан еще один коктейль , содержащий 5% ТХУ, 5% сульфосалициловой кислоты, 18% метанола и 0,02% кумаоси я1ркого синего [1404, 1405]. Белковые полосы становятся видимыми сразу же после окрашивания этим раствором. Для снижения фона гели промывали водой или разбавленной уксусной кислотой. [c.156]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология