Активность ферментов при низких Активные частицы

Активность ферментов очень велика. Например, одна весовая часть амилазы может превратить в мальтозу до миллиона частиц крахмала. Активность ферментов в значительной степени зависит от температуры. Для большинства из них оптимальной является температура от 26 до 45°. Низкие температуры не разрушают ферментов, но действие их настолько замедляется, что вызываемую ими реакцию трудно обнаружить. Нагревание до температуры выше 80° приводит к полному разрушению ферментов. [c.15]

Кинетически такая схема эквивалентна модели, представленной на рис. 1, в которой пути синтеза и гидролиза АТФ различаются. Существование двух форм фермента, катализирующих одну и ту же реакцию с различными кинетическими параметрами, на первый взгляд должно было бы привести к аномальной, не михаэли-совской кинетике гидролиза АТФ препаратами субмитохондриальных частиц, что экспериментально не наблюдается [50]. Кажущееся противоречие, по-видимому, объясняется чрезвычайно низкой АТФазной активностью малого цикла (см. выше), и гидролиз АТФ, максимальная скорость которого составляет лишь доли процента от общей скорости гидролиза, не вносит ощутимого вклада в измеряемые кинетические параметры. [c.47]

Активность ферментов как катализаторов выражали многими способами. Одним из часто используемых способов является выражение ее через число оборотов Т.М. Последнее определяют [1] как число циклов, претерпеваемых во время каталитической реакции одной простетической группой фермента в одну минуту, т. е. как число молекул субстрата, реагирующих в минуту на одном активном центре фермента. Однако применялись и некоторые другие определения числа оборотов при любом способе измерения Т. N. следует указывать концентрацию субстрата и то, была ли она достаточной, чтобы дать максимальную скорость. Другой мерой [8, 3] является начальная константа скорости к реакции при низких концентрациях субстрата, где V = к [8]о[Е]о для реакции с одним субстратом, или к [8]о[Е]о[Т]о для бимолекулярной реакции. Эта характеристика имеет преимущество, являясь доступной мерой для многих реакций, катализируемых ферментами, и, кроме того, для тех же самых реакций в присутствии других катализаторов, которые не могут, например, дать предельно максимальную скорость. Однако, возможно, огромное преимущество может дать отнесение к к числу активных центров в молекуле фермента, точно так же как в кислотно-основном катализе константу скорости каталитической реакции делят на число доступных протонов кислотного катализатора. Аналогичным образом при сравнении фермента каталазы с коллоидальной платиной для реакции разложения перекиси водорода каждая частица может оказаться такой же активной, как и отдельная молекула фермента [8]. Однако каждая частица с радиусом 500 А имеет на поверхности приблизительно 3-10 атомов металла, каждый из которых, возможно, является самостоятельным активным центром, так что, относя к одному центру, можно видеть, что фермент оказывается намного более активным. Как показано в табл. 2, ферментативные реакции характеризуются более низкой энергией активации приблизительно на 10 ктл/моль, это может легко объяснить различие в активностях. В табл. 8 некоторые ферменты сравниваются с другими каталитически действующими ионами. [c.139]

Однако между этими ферментами в реакциях с аскорбиновой кислотой, ароматическими аминами и фенолами имеются существенные различия. Все указанные восстановители реагируют со скоростью, которая практически не зависит от pH, по крайней мере вблизи pH 7. И в этих случаях 54 > 43 и для каталазы, и для пероксидазы хрена, однако обе константы скорости в случае каталазы существенно меньше, чем соответствующие константы скорости для пероксидазы. Гваякол и л-аминобензойная кислота восстанавливает Fe -пероксидазу хрена ( 54 = 9-10 и 5-10 л-моль - с 1 соответственно) примерно в 25—30 раз быстрее, чем комплекс Fe того же фермента ( 43 = 3-10 и 2-10 л-моль - "i) [34]. Для каталазы соответствующие константы скорости не получены. Пирогаллол восстанавливает Fe -каталазу ( 54=2,4 10%-моль - с 1) [159] примерно в 30 раз быстрее, чем Ре -каталазу ( 43 = = 80 л -моль -с ) [159]. Однако последняя константа скорости на несколько порядков меньше, чем соответствуюшле константы для пероксидазы хрена ( 43 = 3-10 л-моль 1-с ) или для небелкового комплекса железопротопорфирина в присутствии избытка гистидина (( 43 = 6-10 л-моль" -с ) [219]. Можно также сравнить скорости реакций аскорбиновой кислоты при pH 7 с комплексами Fe -каталазы ( 54 = 300 л-моль -с ) 159], пероксидазы хрена ( 54 = 1,8-10 ) [49] и небелковым Fe -дейтеропорфирином ( 54 10 л-моль 1-с 1) [178]. Реакция с Fe -каталазой идет слишком медленно, чтобы ее можно было практически наблюдать. Таким образом, низкая активность каталазы в реакциях перекиси водорода с пирогаллолом и аскорбиновой кислотой обусловлена необычно низкими значениями констант 54 и 43 (табл. 16). По-видимому, белок в каталазе в действительности подавляет восстановление Fe и Fe такими большими молекулами, как пирогаллол или аскорбиновая кислота (примерно в 1000 раз), но не такими малыми частицами, как нитрит-ион. Как видно из данных табл. 16, эффект ингибирования становится еще больше (примерно в 10 раз) в случае таких реагентов, как гваякол и адреналин. То, что ингибирующий эффект белка обусловлен пространственными за- [c.216]

Влияние размера конъюгата. Сигмоидный характер кривой титрования в ее верхней области, т. е. в области относительно высокой загрузки первичными антителами, позволяет предположить, что а) в области более высокой концентрации антител пространственные затруднения для работы системы детектирования возрастают или б) связывание конъюгатов с различным молярным соотношением фермент антитело или с ферментативной активностью, отличной от активности конъюгатов, преимущественно связывающихся в области низкой концентрации антител, происходит избирательно. Второе из названных предположений кажется маловероятным ввиду однородности состава ИФК, используемого в a-ELISA (см. рис. 14-2), Поэтому мы исследовали влияние на форму кривой титрования конъюгатов различного состава с разной способностью вызывать пространственные затруднения при связывании. Для этого использовали системы, схематически показанные на рис. 14-1. Размер частиц конъюгата определяли ультрацентрифугированием в сахарозном градиенте аналогично тому, как это делали при получении данных на рис. 14-2. Было установлено, что конъюгаты, полученные с помощью глутарового альдегида, представляют собой крупные агрегаты, в то время как конъюгаты на основе Fab однородны по размеру и имеют мол. массу [c.229]

Если бы ферментный электрод функционировал в условиях кинетического контроля, концентрационная зависимость тока была бы нелинейной, и рабочий диапазон охватывал бы лищь концентрации в пределах одного порядка. Однако, как отмечено выше, в таких сенсорах между слоем фермента и анализируемым раствором находится мембрана. Она создает барьер для активных частиц, и отклик сенсора пропорционален диффузионному потоку, который не лимитируется кинетикой ферментативной реакции, пока активность фермента не становится слишком низкой. Вот почему отклик амперометрического электрода остается постоянным в течение продолжительного периода и затем внезапно падает. Как отмечалось в работе [36], сигнал сенсора не зависит от активности фермента, пока последняя достаточно высока. Однако активность фермента постепенно уменьшается и со временем достигает уровня, при котором отклик сенсора становится контролируемым кинетически и не является более постоянным. Более подробно теория ферментного электрода и свойства иммобилизованных ферментов обсуждаются в ряде публикаций [4, 14, 26, 47]. Идеальным был бы случай, когда используют тонкую мембрану, через которую кислород переносится лучше, чем глюкоза, и поэтому в реакционном слое он находится в избытке. Разработка мембран с такими особыми свойствами несомненно будет благоприятствовать развитию биосенсоров всех типов. [c.144]

Основные недостатки этого способа иммобилизации — низкая скорость процесса вследствие небольшой площади поверхности раздела фаз, через которую осуществляется перенос субстрата и продукта, и возможность инактивации фермента при его адсорбции на границе раздела фаз. Именно последнее обстоятельство не позволяет применять интенсивное перемешивание системы для увеличения скорости процесса за счет возрастания пoвepxнo fи раздела, поскольку в образующейся эмульсии фермент быстро теряет активность. Чтобы преодолеть это затруднение и добиться увеличения поверхности раздела, в качестве ферментсодержащей фазы часто применяется крупнопористый неорганический носитель (например, пористое стекло), частицы которого пропитаны водным раствором фермента (рис. 10, б). [c.73]

Функция есть феномен, проявляющийся в результате активности какого-либо органа (S hoffeniels, 1976). Это определение правильно на физиологическом уровне. Однако на молекулярном уровне, например для случая репликации ДНК и транскрипции, функция становится результатом координированной активности ряда макромолекул. Важно помнить, что сама по себе ДНК не может реплицироваться или транскрибироваться. Эти функции могут ею выполняться только во взаимодействии с несколькими ферментами, такими как ДНК-и РНК-полимеразы. Функция осуществляется в результате специфичного и согласованного взаимодействия между макромолекулами, в данном случае — между белками и нуклеиновыми кислотами. Конкретнее, функция есть результат взаимного узнавания специфичных групп аминокислот и оснований— компонентов макромолекул обоих типов. Таким образом, подобно тому как для функционирования органа требуется сотрудничество различных клеток, так для функционирования макромолекул необходима совместная активность различных видов молекул. На более низких уровнях организации частиц, включая простые молекулы, также необходимо сотрудничество — координация действия различных атомов и [c.178]

Смена колонок осуществляется очень легко колонку просто вставляют в нижний конец пластиковой трубки, служащей для установки колонки в прибор и содержащей выходной патрубок и термодатчик. Можно использовать колонки различного диаметра (максимальный внутренний диаметр 7 мм) и высоты ферментного слоя (максимум 30 мм). Носителем фермента может служить найлоновая трубка, намотанная на специальный адаптер, который вставляется в держатель колонки и связывает трубку с проточной системой. Найлоновая трубка удобна для анализа неочищенных проб, содержащих твердые частицы [27], но имеет низкую ферментную емкость. Обычно в качестве носителя используют пористое стекло с контролируемым размером пор, которое не только обладает высокой ферментной емкостью, хорошей механической прочностью, химической и микробной устойчивостью, но и позволяет применять сравнительно простые методики иммобилизации фермента. В ряде работ [7, 31] применяли и другие материалы. Разные носители существенно различаются по способности к адсорбции компонентов анализируемых растворов, что зависит, например, от реального распределения на их поверхностях ионных и гидрофобных групп. Поскольку такая адсорбция почти наверняка вызывает неспецифическое выделение тепла и даже может влиять на ферментативную реакцию, выбор материала носителя весьма существен. Хорошие результаты получаются при использовании пористого стекла с размерами пор от 500 до 2000 А и частиц-около 80 меш. Если используют необработанное или обработанное алкилпропиламином пористое стекло, полученное из разных источников, активация стекла глутаровым альдегидом с последующей иммобилизацией фермента почти всегда дает хорошие результаты. Следует отметить, что обычно в колонку термистора вводят довольно большой избыток фермента (нередко 100 ед. активности). Эта процедура обеспечивает стабильность работы и неизменность характеристик системы при большом числе проб и в случае длительных [c.460]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология