Эндонуклеазы вирусные

После этого образуется цепь (возможно, в форме отдельных фрагментов), комплементарная одноцепочечному хвосту . При полном обороте кольца получается цепь вирусной ДНК в два раза длиннее обычной. Процесс репликации завершается ее расщеплением при помощи соответствующей эндонуклеазы и сшиванием комплементарных нитей в кольцо лигазой. [c.278]

Действие рестриктирующих эндонуклеаз. Замкнутую кольцевую вирусную ДНК обрабатывают рестриктирующей эндонуклеазой. В этой ДНК есть один сайт рестрикции со следующей структурой [c.893]

Дезоксирибонуклеазы (К-Ф.3.1.4.5) — собирательное название многих с различной степенью специфичности гидролизующих ДНК ферментов. Их можно разделить на две группы эндонуклеазы и экзонуклеазы. Эндонуклеазы весьма условно также делятся на две группы — ДНК-аза I и ДНК-аза П. Действие ферментов первой группы приводит к образованию из ДНК дезоксинуклеозид-5 -фосфатов. Действие второй группы заканчивается образованием дезоксинуклеозид-З -фосфатов. Со временем все очевиднее становится условность такого разделения, поскольку между этими двумя крайними случаями обнаруживается большая часть других ферментов этого класса. В настоящее время описано много ДНК-специфических эндонуклеаз различного биологического происхождения. Большой теоретический и практический интерес среди них представляют так называемые рестриктазы — эндонуклеазы, которые весьма специфически, в зависимости от нуклеотидной последовательности расщепляют ДНК- Такими являются, например, бактериальные эндонуклеазы, способные расщеплять вирусную ДНК, отличающуюся от ДНК хозяина характером структурной модификации. [c.48]

Другой подход к созданию стабильных мутантов заключается в использовании делеционных мутаций, которые должны быть стабильными, так как они не подвергаются реверсиям и вряд ли угнетаются новыми мутациями на другом участке вирусного генома. По этой причине в настоящее время предпринимаются усилия для получения стабильных делеционных мутаций, которые делали бы вирус достаточно дефектным, для того чтобы он стал аттенуированным, но не настолько дефектным, чтобы он потерял жизнеспособность. Генетическая хирургия этого типа с использованием рестрикционных эндонуклеаз может быть осуществлена только на молекуле ДНК. Следовательно, вирусные геномы, состоящие из РНК, должны быть транскрибированы в ДНК, а затем в этой форме их можно подвергать манипуляциям. Это ставит нас перед трудной задачей транскрибирования мутантной ДНК в такую РНК, которую можно перенести обратно в инфекционный вирус. [c.174]

Первые две активности необходимы для синтеза вирусной ДНК, а эндонуклеаза, по-видимо- [c.26]

Третье различие между системами репликации ДНК фагов Т4 и Т7 касается способа превращения конкатемера в зрелый мономерный геном. В первом случае длина сегмента ДНК, отрезаемого от конкатемера, задается не специфической нуклеотидной после-доватачьностью (как у Т7), а вместимостью фаговой головки кон-катемерная молекула ДНК начинает упаковываться в головку, а когда головка заполнится, активируется эндонуклеаза, которая отщепляет оставшийся снаружи участок молекулы. Поскольку в головку помещается сегмент ДНК, превышающий по своим размерам уникальную последовататьность вирусного генома, повторение актов упаковки и нарезания генерирует молекулы с кольцевыми перестановками и прямыми концевыми повторами (рис. 147). Отметим, что в фаговом геноме закодирован фермент, способствующий превращению разветвленных молек л ДНК в линейные. [c.280]

Известно, что для инициации процесса репликации ДНК фага ФХ необходимо наличие в геноме фага специфического гена А. Недавно было показано, что этот ген детерминирует синтез белка с мол. весом 56 000 — специфической эндонуклеазы надрезающей вирусную цепь RF-формы, что необходимо для начала процесса репликации [209]. По-видимому, после появления такого разрыва стимулируется синтез небольшого участка РНК-затравки. Репликация ДНК протекает в большинстве случаев в двух направлениях (разд. Д,2), однако репликативная форма Ф X образуется, вероятно, только в одном направлении по механизму разматывающегося рулона (rolling ir le) [210]. В соответствии с этим механизмом [уравнение (15-9)], по мере того как вновь образующаяся цепь вирусной ДНК синтезируется вдоль комплементарной (минус) цепи-матрицы, исходная вирусная ДНК (плюс-цепь) вытеснется в виде одноцепочечного хвоста . [c.278]

Микроорганизмы, синтезирующие эндонуклеазы рестрикции, выработали систему самозащиты они метилируют одно или несколько оснований рестриктазного сайта, и расщепление ДНК в этом сайте гомологичной эндонуклеазой рестрикции блокируется. Грамотрицательные микроорганизмы имеют еще один механизм защиты эндонуклеазы рестриьщии у них локализованы в периплазматическом пространстве. Благодаря такой компартментализации происходит физическое разделение рестриктаз и ДНК и при этом обеспечивается свободный доступ метилирующего (модифицирующего) фермента к хромосомной ДНК. Кроме того, это защищает клетку от проникновения в нее любой чужеродной ДНК, например вирусной. [c.248]

Если тщательно и осторожно выделять кольцевые вирусные ДНК, то можно показать, что они являются сверхспи-ралъными, или сверхскрученными. Создается впечатление, что двойная спираль прежде, чем концы ее цепей соединились в кольцо, была частично раскручена. Это обратное скручивание сообщает кольцевой молекуле ДНК вращающий момент, вследствие чего она закручивается сама на себя (рис. 27-18). Если такую сверхспиральную ДНК, в которой запасена дополнительная энергия, подвергнуть действию эндонуклеазы, разрывающей одну из цепей, то скрученность, вызванная обратным вращением, снимается и ДНК переходит в свое обычное низкоэнергетическое релаксированное состояние (рис. 27-18). Сверхспиральная вирусная ДНК более компактна, чем релаксированное кольцо. [c.870]

У разных видов бактерий обнаружено уже свыше 150 различных рестриктирующих эндонуклеаз. Некоторые бактерии содержат больше одного набора модифицирующих метилаз и рестриктирующих эндонуклеаз. Однако ДНК вирусов бактерий научились с помощью ряда способов преодолевать рестрикционную защиту клеток их хозяев. Некоторые вирусные ДНК содержат разного рода модифицированные основания, которые позволяют им избегать расщепления ре-стриктирующими эндонуклеазами клетки-хозяина, в которую они попали. Модифицирующими группами в таких вирусных ДНК служат метильные, ги-дрокСиметильные и глюкозильные группы. Другие вирусы в ходе эволюции приобрели такие последовательности в ДНК, которые не содержат участков, узнаваемых некоторыми рестриктирую-щими эндонуклеазами. [c.881]

Двумерный электрофорез в полиакриламидном геле может быть также использован для локализации участков ДНК, отвечающих 5 - и З -концевым последовательностям и точкам внут-)имолекулярного переплетения ядерной или вирусной РНК 116]. С этой целью продукт гибридизации РНК и ДНК обрабатывают эндонуклеазой S1, специфичной по отношению к одноцепочечным нуклеиновым кислотам, и полученные гибриды комплементарных фрагментов ДНК и РНК разделяют в соответствии с их размерами с помощью гель-электрофореза. Затем в денатурирующих условиях проводят электрофорез во втором направлении, с тем чтобы определить размер образующихся одноцепочечных фрагментов ДНК. Специфические последовательности обнаруживают с помощью блоттинга по Саузерну и последующей молекулярной гибридизации [116]. Одноцепочечные фрагменты ДНК можно легко разделить с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в щелочной среде. Денатурированные образцы подвергают гель-электрофорезу в буфере, содержащем 30 мМ NaOH и 2 мМ ЭДТА [117]. По своему поведению в этих условиях электрофореза такие фрагменты похожи на одноцепочечные фрагменты РНК (разд. 10.5.2). [c.187]

ЭТОМ чужеродная ДНК, не имеющая этих опознавательных метильных групп, разрущается рестриктирующими эндонуклеазами. В эукариотических ДНК присутствует большое число высокоповторяющихся коротких последовательностей, меньшее число более длинных умеренных повторов, которые, как полагают, играют регуляторную роль, и ряд уникальных (неповторяющихся) участков, представляющих собой, видимо, структурные гены. Эукариотические гены содержат вставочные нетрансли-руёмые нуклеотидные последовательности, называемые интронами, которые вставлены между транслируемыми участками, называемыми экзонами. С помощью недавно разработанных методов были определены нуклеотидные последовательности ряда генов и вирусных ДНК. [c.891]

Этот первый метод выделения генов был разработан в конце 1960-х — начале 1970-х гг. Его появление стало возможным благодаря открытию ферментов, называемых рестрикционными (от англ. restri ting — ограничивающий) эндонуклеазами или рестриктазами. Эти ферменты обнаруженные в бактериях, способны разрезать ДНК, например они разрезают любую вторгающуюся в бактериальную клетку вирусную ДНК, ограничивая (рестрицируя) таким образом размножение вирусов внутри клетки. Разные виды бактерий продуцируют различные рестрикционные эндонуклеазы. Каждая из них разрезает нуклеиновую кислоту (отсюда, нуклеаза ) в строго определенных точках ( эндо означает, что фермент разрезает молекулу изнутри, а не атакует ее с концов). Фермент распознает некую последовательность оснований и взаимодействует именно с ней. Точки разрезания называются сайтами рестрикции. К настоящему времени выделено более 2000 рестриктаз, активных в отнощении 230 разных последовательностей. Свою собственную ДНК бактерия защищает путем присоединения к определенным основаниям в сайтах рестрикции метильной группы. [c.219]

Из фрагментов вирусных и бактериальных хромосом уже выделен целый ряд генов. Что же касается выделения специфических генов из фрагментированных эукариотических хромосом, то реализация этой процедуры все еще остается довольно сложной и трудоемкой задачей. Существует два основных подхода для получения специфических генов, подлежащих затем рекомбинации и клонированию. В одном из них, который получил название шотган (от англ. shotgun-дробовик), всю клеточную ДНК обрабатывают рестриктирующей эндонуклеазой, образующей в местах разрыва выступающие концы. Полученные фрагменты ДНК встраивают затем в плазмиды Е. соИ, раскрытые (т.е. переведенные в линейную форму) с помощью той же самой рестриктирующей эндонуклеазы. В результате образуется чрезвычайно сложная смесь, состоящая, вероятно, из тысяч разных рекомбинантных плазмид, среди которых лишь одна может содержать нужный ген. Для поиска плазмиды, несущей этот ген, разработаны специальные процедуры, которые называют скринингом. Одна из таких процедур описана в разд. 30.17. [c.983]

ДНК> модель разматывающегося рулона — система представлений, предложенная для объяснения репликации ковалентно замкнутых кольцевых ДНК. Модель разматывающегося рулона возникла благодаря открытию (+)-цепей ДНК. превосходящих по длине зрелый вирусный геном, (—)-цепеЙ в виде ковалентно замкнутых одноцепочечных колец, а также длинных (- -)-цепей с З -гидроксильным концом, лежащим на матричном кольце, и свободным 5 -гидроксильным концом, выходящим В раствор. Эта модель довольно удачно объясняет строение реплицирующёйся ДНК некоторых бактериофагов (ФХ174, Т4 к) и кишечной палочки, состоящей из двух ковалентно замкнутых кольцевых цепей. В этой структуре (+)-цепь в определенной точке разрывается эндонуклеазой. При этом освобождаются З -гидрокснльная и -фосфатная группы. 5 -Фосфатная группа прикрепляется к какому-то участку мембраны, а цепь начинает наращиваться с З -гидроксильного конца, достраиваясь на матрице (—)-цепи, которая при этом продолжает оставаться замкнутой. В таком виде она представляется бесконечной матрицей в виде кольца. [c.52]

Эндонуклеазы вирусов млекопитающих — ферменты, индуцируемые вирусами в клетках млекопитающих. Эго наименее изученные эндонуклеазы ДНК. Известно, что после заражения клеток млекопитающих различными вирусами эндонуклеазная активность в них повышается. Установлено, что некоторые из этих ферментов составляют часть структуры вируса. Другие ферменты могут синтезироваться в клетках хозяина в ответ на вирусную инфекцию. [c.89]

Морфологичекая картина развивающегося апоптоза складывается из первоначальной конденсации хроматина и образования везикул, которые выходят во внеклеточное пространство. На этой ранней стадии процесса клеточная мембрана еще остается целой. Позднее наблюдаются более выраженая конденсация хроматина, потеря цитоплазмы и мембраны, что и характеризует собственно клеточную смерть. Факторы, включенные в апоптоз, и в частности эндонуклеазы, могут принимать участие в деструкции ДНК не только клетки, но и самих вирусных частиц, препятствуя их проникновению в соседние клетки. [c.230]

Множество биохимических (Air, 1979) и электронно-микроскопических (Evenson, 1977) методов было использовано для анализа вирусных геномов дикого, дефектного и спасенного типов. Эти методы включают спасение дикого типа с дефектным и спасенным по отношению к рестрикционной эндонуклеазе вирусом или другим резанным эндонуклеазой фрагментам, гибридизацию нуклеиновых кислот, картирование гетеродуплекса, R-петли, секвенирование ДНК. С помощью таких методов можно определить локализацию делеции, замещения, инверсии, дополнения и т. д. в вирусных геномах. Замещенные последовательности клетки хозяина которые предположи- [c.195]

Инфицирование клетки вирусом вызывает синтез ИФа/р. Под действием интерферонов активируются защитные механизмы соседних клеток, обеспечивая их устойчивость к вирусной инфекции рис. 16.4). Активация затрагивает гены ряда белков, в том числе двух, обладающих прямой антивирусной активностью. Это протеинкиназа (мол. масса 67 кДа), которая фосфорилирует а-субъеди-ницу инициирующего трансляцию фактора е Р-2 и тем самым инактивирует его, блокируя в результате синтез вирусных белков, и другой фермент -2, 5 -олигоаденилатсинтетаза, активирующая латентную в обычных условиях эндонуклеазу, способную разрушать вирусные РНК. [c.307]

Первые указания на существование интронов появились при изучении вирусов животных. Было установлено, что нуклеотидные последовательности различных матричных РНК не коллинеарны нуклеотидным последовательностям вирусной ДНК, с которых они транскрибированы, хотя, казалось бы, матричные РНК должны состоять из нуклеотидных последовательностей, соответствующих непрерывным сегментам вирусной ДНК. Обнаружилось также, что последовательности р-глобиновой мРНК гибридизуются с набором геномных фрагментов, полученных с помощью эндонуклеаз рестрикции, суммарный размер которых значительно превышает размер мРНК. Эти данные свидетельствуют о том, что полинуклеотидные фрагменты, составляющие матричную РНК, соответствуют участкам ДНК, разбросанным по нескольким областям генома. [c.7]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология