Гибридные белки с галактозидазой

Таблица 4.9. Расщепление трипсином гибридного белка -галактозидаза— -эндорфин

Таблица 4.7. Расщепление бромистым цианом гибридных белков Р-галактозидаза-А-цепь инсулина и -галактозидаза—В-цепь инсулина

Выделите А- и В-цепи инсулина из гибридных белков с р-галактозидазой, взяв для начала 24 г влажного осадка клеток (см. табл. 4.7). [c.119]

ПОЛУЧЕНИЕ И ОЧИСТКА ПОЛИКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ГЕТЕРОЛОГИЧНЫМ ФРАГМЕНТАМ ГИБРИДНЫХ БЕЛКОВ, СОДЕРЖАЩИХ -ГАЛАКТОЗИДАЗУ [c.138]

Введение. Векторы для экспрессии гибридных белков, содержащих -галактозидазу [c.138]

Имеются три основных побудительных мотива к использованию гибридных белков, содержащих -галактозидазу. В зависимости от характера конкретной задачи они сводятся к следующему. [c.141]

Чтобы снизить вероятность получения ошибочных результатов, мы советуем исследовать лизат, содержащий гибридные белки, с помощью вестерн-блот-анализа с использованием антител к -галактозидазе (рис. 5.3) —это позволяет детектировать все минорные продукты. Кроме того, все получаемые результаты необходимо сопоставить с анализом нуклеотидной последовательности клонированный ДНК. Для идентификации продуктов клонированных генов можно также использовать вторые антитела, специфичные к антигенным детерминантам, которыми предположительно должен обладать гибридный белок. Поскольку уровень экспрессии гибридных белков высок, мы рекомендуем использовать иммуноферментный метод выявления антигенов с помощью вестерн-блот-анализа (табл. 5.2) ввиду надежности и быстроты этого метода. [c.149]

Получите лизат клеток, продуцирующих гибридные белки, как описано в разд. 5.2 и табл. 5.1. Нанесите его на 7,5%-ный ПААГ для проведения ДСН-электрофореза. Нанесите на соседние дорожки маркерные высокомолекулярные белки, включая и -галактозидазу. [c.152]

Экстракты, выделенные, как описано в разд. 5.3.2 (п. 2, 3 или 4), могут быть непосредственно нанесены на аффинные колонки, содержащие антитела к -галактозидазе без какого-либо предварительного фракционирования (например, удаления нуклеиновых кислот). Поэтому гибридные белки, характеризующиеся низкой стабильностью или низким содержанием в клетке, могут быть легко выделены из разбавленных экстрактов без деградации, возможной при более длительных методах выделения. [c.157]

На колонку, содержащую 5 мг -галактозидазы или 5 мл смолы, сшитой с гибридным белком (табл. 5.6), нанесите 10—20 мл антисыворотки. Проводите элюцию PBS и промывайте колонку буфером BBS-твин ) до тех пор, пока с нее не перестанет сходить белок. Уравновесьте колонку PBS. Для обеспечения наиболее полной элюции элюируйте связавшиеся антитела 4 М гуанидинхлоридом. Диализуйте собранный пик против 100 объемов PBS ) как минимум три раза, диализуя раствор против каждой смены буфера не менее трех часов. Снова уравновесьте колонку 3—5 объемами PBS. [c.167]

Промойте колонку элюирующим буфером и снова уравновесьте ее PBS, как описано в табл. 5.7. Нанесите на колонку несвязавшуюся фракцию антисыворотки с колонки, содержащей иммобилизованную -галактозидазу, промойте ее и элюируйте фракцию, содержащую антитела к гибридному белку, как [c.167]

Регистрируя оптическую плотность белкового материала с помощью соединенного с колонкой высокочувствительного спектрофотометра, нанесите еще раз фракцию диализованных антител, полученных на стадии 4, на аффинную колонку с иммобилизованной -галактозидазой, уравновешенную PBS для удаления возможных примесей антител к -галактозидазе. Теперь фракция, сходящая с колонки, должна содержать только антитела к чужеродному фрагменту гибридного белка. [c.168]

Этот ПОДХОД был использован при клонировании гена соматостатина-пт-тщного гормона (14 аминокислотных остатков) из гипоталамуса, регулирующего секрецию инсулина, глюкагона и гормона роста. Ген соматостатина был в этом случае синтезирован химически и присоединен к концу гена 3-галактози-дазы. Два связанных между собой гена были встроены в плазмиду Е. соИ, и полученная рекомбинантная плазмида была введена в клетки Е. oli. В результате такие клетки синтезировали большие количества гибридного белка, состоящего из ковалентно соединенных друг с другом Р-галактозидазы и соматостатина. Такая молекула, представляющая собой гибрид собственного белка Е. oli и белка позвоночного организма, называется химерным белком. Гибрид р-галактозидазы и соматостатина расщепляли по пептидной связи, соединяющей два белка, что приводило к освобождению обладающего биологической активностью соматостатина. [c.988]

Альтернативные методы скрининга космидных библиотек, описанные в гл. 3, предполагают селекцию космидных клонов с использованием феномена гомологичной рекомбинации in vivo. Остальные главы книги посвящены вопросам, связанным с экспрессией клонированных генов. Для многих белков млекопитающих удалось осуществить высокопродуктивную внутриклеточную экспрессию в Е. oli. Однако гетерологические белки, локализующиеся в цитоплазме, часто образуют трудно растворимые агрегаты, что значительно осложняет получение нативного продукта. В гл. 4 описаны эффективные способы выделения активных растворимых продуктов из нерастворимых белков цитоплазмы Е. соИ. Вероятность деградации специфическими бактериальными протеиназами многих эукариотических белков, синтезируемых в Е. oli, может быть существенно снижена, если их экспрессировать в виде гибридных белков. Такие составные белки, в которых бактериальный компонент обычно представлен -галактозидазой, можно использовать в качестве иммуногенов для получения антисыворотки и моноклональных антител к клонированному эукариотическому белковому домену. Эти вопросы >ассматриваются в двух главах — одна посвящена получению поликлональной антисыворотки, а другая — методам гибридной технологии. В последующих главах книги описаны современные эукариотические экспрессирующие системы в гл. 7 — дрожжевая, далее в трех главах — системы на основе культивируемых клеток млекопитающих и трансгенные животные. В частности, описана система экспрессии с использованием векторов, которые несут гены, обеспечивающие возможность их индуцибельной амплификации это позволяет снимать токсическое действие антибиотиков, введенных в культуральную среду. Клонированные в таком векторе гены также [c.8]

В случае полипептидов, не содержащих метионина, для образования составного белка обычно используют метиониновую сшивку, которую в будущем можно расщепить бромистым цианом. Одним из примеров такого подхода служит присоединение р-галактозидазы к А-и В-цепям инсулина [11] соответствующая методика приведена в табл. 4.7. Гены гибридных белков, содержащих А- и В-цепи, клонированы и экспрессируются по отдельности. Перед расщеплением бромистым цианом агрегировавшие белки инкубировали в 6 М гуанидинхлориде и 1%-ном (объемная концентрация) 2-меркаптоэтаноле. Такая обработка должна приводить к развертыванию молекул гибридных белков и ослаблению всех имеющихся внутримолекулярных или межмоле-кулярных дисульфидных связей. Опять же такая предварительная обработка может оказаться необходимой, чтобы связь ме-тионин-Х стала доступной для расщепления. [c.106]

Рис. 4.5. Структура. шкерного участка, соединяющего проинсулиновые домены в гибридном белке, состоящем из -галактозидазы и множественных тандемных копий проинсулина [25].

Гибридный белок САТ-кальцитонин [20] (табл. 4.11) был сконструирован так, чтобы его можно было очистить субстрат-аффинной хроматографией. Когда обнаружилось, что гибридный белок находится в нерастворимом состоянии, стало очевидным, что этот подход неприемлем. Другие гибридные белки, приведенные в табл. 4.11, были также сконструированы с расчетом на очистку с помощью аффинной хроматографии. Для выделения составного белка -галактозидаза-Х использовали -aминoфeнил- -D-тиoгaлaктoзид (субстратный аналог -галактозидазы [27]) и белок А, специфически связывающийся с фрагментом F иммуноглобулина G [28]. Эти гибридные белки, синтезируемые в клетках Е. oli, растворимы метод их очистки описан в разд. 4.4. [c.113]

В клетках Е. oli была осуществлена также экспрессия белков, содержащих большое число субъединиц, и осуществлено их выделение из нерастворимых комплексов. Для получения мутантных гемоглобинов осуществляли синтез в клетках Е. соИ Р-глобина в виде гибридного белка р-галактозидаза — р-глобин и выделяли этот белок методом, описанным в разд. 4.3.2.2 [23] (табл. 4.10). После расщепления гибридного белка, диализа и лиофилизации конформацию гемоглобина восстанавливают, используя следующую методику [23]. [c.125]

Возможность экспрессии клонированных эукариотических генов в клетках Е. соИ способствовала углубленному изучению множества белков, представляющих интерес для фундаментальных научных исследований и медицины. В тех случаях, когда нативный негибридный белок экспрессируется недостаточно эффективно, часто экспрессия белков или их фрагментов в виде гибридов с полипептидами Е.соИ, такими, как -галактозидаза, оказывалась более успешной. К тому же гибридные белки можно легко очищать с помощью хроматографических методов, разработанных для -галактозидазы. Эукариотические белки, экспрессируемые в составе гибридных продуктов, были с успехом использованы при изучении иммунологически важных участков поверхностных антигенов [1], функций рекомбинантных полипептидов [2], при получении иммунологических зондов, необходимых для исследования ранее не изученных антигенов [3—6], для экспрессии вариантных форм белковых субъединиц и для выделения и исследования клонов ДНК из экспрессирующихся библиотек генов [8—10]. Технология работы с экспрессирующими векторами достигла столь высокого уровня развития, что стало возможным осуществлять в клетках Е. соН достаточно эффективную экспрессию практически любой кодирующей последовательности с образованием гибридного продукта, который можно выделить с помощью разнообразных биохимических методов и использовать его либо в различных функциональных исследованиях либо в качестве иммуногена. Синтез чужеродного полипептида в виде гибридного белка с -галактозидазой, по всей вероятности, значительно увеличивает стабильность этого полипептида в клетках Е. соИ. По-видимому, стабильность белка, а не сила промотора — наиболее важный фактор для успешной экспрессии рекомбинантных белков в бактериях. [c.138]

В отличие от Agtll гибридные белки с -галактозидазой, кодируемые плазмидами pUR, обычно сохраняют ферментативную активность. Примерно 18 С-концевых аминокислотных остатков -галактозидазы, отсутствующие в гибридных белках, синтезируемых в gll, необходимы для проявления ее ферментативной активности. По нашим данным, гетерологичные фрагменты гибридных белков, включающих -галактозидазу, также более стабильны в клетках Е. соИ, когда соответствующие гены экспрессируются в pUR-векторах, а не в Agtll. Возможно, это свидетельствует о влиянии конформации -галактозидазы на конформацию гетерологичного белкового фрагмента в составе белкового гибрида. [c.140]

Рпс. 5,3. Два примера аномального поведения гибридных белков. Фрагмент кДНК Antennapedia был встроен в вектор Xgtll в двух разных рамках считывания. Самый большой по размеру из мажорных продуктов (дорожка 1) синтезируется при считывании с неправильной рамкой, но вследствие чрезвычайно высокого содержания G в ДНК и пролина в белке образующийся продукт обладает такой же подвижностью, как продукт, кодируемый правильной рамкой считывания черная стрелка, дорожка 1). Вторая рамка считывания (дорожка 2) правильная, и размер ее мажорного продукта (дорожка 2, черная стрелка) также соответствует заранее рассчитанному. Однако этот белок не является полноразмерным гибридным белком. Минорный продукт большего размера (дорожка 2, светлая стрелка) выявляется при окрашивании с использованием антител к -галактозидазе (данные не представлены) и антител к С-концевому участку белка (данные не приведены). Высокое содержание пролина в гибридном белке приводит к увеличению кажущейся молекулярной массы на 10—15 кДа. Этим объясняется ошибочный вывод о том, что обладающий низкой подвижностью продукт деградации является полноразмерным белком. [c.146]

Размер гетерологичного белкового фрагмента — важный параметр при клонировании гибридных белков, содержащих -галактозидазу. Стабильность (а следовательно, и выход) гибридных белков, как правило, снижается при увеличении размера чужеродного фрагмента. Во многих случаях желательно, чтобы в состав гибридных белков входили короткие фрагменты. Для получения специфических антител вполне достаточными оказываются фрагменты гетерологичной ДНК, кодирующей антиген длиной всего 200 п.н. [16]. Вместе с тем использование коротких фрагментов может привести к тому, что при небольшой относительной массе чужеродного полипептида (по сравнению с массой -галактозидазы) титр специфичных к чужеродному белку антител у иммунизированных животных окажется низким. Аффинная очистка антител в этом случае также менее эффективна вследствие низкой емкости аффинных колонок, в которых связанные с носителем гибридные белки несут короткие гетерологичные фрагменты. Один из путей решения этой проблемы состоит в увеличении молярного соотношения гетерологичный фрагмент -галактозидаза в гибридном белке. Это достигается пришиванием к гену la Z множественных тандемных копий гетерологичного фрагмента ДНК. На рис. 5.5 приведены сравнительные результаты клонирования и экспрессии одной из пяти копий кодирующего фрагмента гена ftz Drosophila в pUR291. Выход гибридного белка, кодируемого одной копией этого гена, примерно в десять раз превышает выход белка, кодируемого пятью тандемными копиями. [c.147]

Клоны с иммобилизованными антителами к -галактозидазе можно приготовить, как это описано в разд. 5.4, или использовать коммерческие препараты. Возможность повторного использования колонки зависит от свойств антител (моноклональных или поликлональных) и жесткости элюирующих растворов. Колонки с поликлональными антителами (полученные, как здесь описано) могут быть использованы более 20 раз без значительного уменьшения их связывающей способности. Колонка, содержащая 5 мг аффинноочищенных поликлональных антител к -галактозидазе, обычно связывает по меньшей мере 1 мг гибридного белка. [c.157]

Для определения количества специфичных к гибридному белку антител, присутствующих в сыворотке, и для получения препарата антител, не загрязненного антителами к -галактозидазе, антисыворотку к гибридному белку сначала наносят на аффинную колонку, содержащую иммобилизованную -галактозидазу. Для подготовки такой колонки используют 5—7 мг очищенной -галактозидазы Е. oli (Sigma) диализованной против PBS. Метод подробно приводится в табл. 5.6. [c.165]

Антитела выделяют, как описано в табл. 5.7. Поскольку фракция антител, специфичных к геторологичному фрагменту гибридного белка не связывается с колонкой, ее собирают без значительных потерь, промывая колонку PBS. Элюируемая фракция антител, специфичных к -галактозидазе, служит хорошим контролем в опытах, где используются антитела к гибридным белкам, и может применяться для приготовления аффинных колонок для выделения гибридных белков (см. ниже). [c.165]

Уравновесьте колонку PBS > при 4°С. Нанесите на нее при 4°С обогащенный экстракт индуцированной лизогенной культуры или клона, несущего плазмид) pUR, содержащий не менее 3—5 мг интактного гибридного белка. Промойте колонку одним объемом PBS при 4 °С, затем, уже при комнатной температуре, промойте ее тремя объемами ВВ5-таин >, двумя объемами 0,1 М бората натрия (pH 8,2) и двумя объемами 0,2 М триэта-ноламина (pH 8,2) для удаления несвязавигегося белка и подготовки для сшивания связавшегося гибридного белка с иммобилизованными антителами к -галактозидазе. [c.168]

Препарат антител, очищенных стандартным способом, как описано в этом разделе, не будет связываться с -галактозидазой или антигенами Е. oli, а будет взаимодействовать со всеми формами гибридного белка, содержащими антигенные детерминанты гетерологичного фрагмента (рис. 5.4, крайняя правая дорожка). [c.169]

Вестерн-блот-анализ гибридного белка Gal.T.HA, при котором в качестве зонда использовались моноклональные антитела к большому Т-антигену, показал, что гибридный белок подвергался деградации по всей длине. Например, антитело РАЬ423 (рис. 6.3), узнающее эпитоп, расположенный в С-концевом участке большого Т-антигена, связывается только с полосой на электрофореграмме, соответствующей белку с самой большой молекулярной массой, т. е. полноразмерным гибридным белком. Антитело РАЬ204, узнающее эпитоп, занимающий участок между аминокислотами 453 и 469 [5], взаимодействует с разными полосами, которые соответствуют как полноразмерным белковым продуктам, так и полипептидам с меньшей молекулярной массой, чем -галактозидаза. [c.178]

Смотреть страницы где упоминается термин Гибридные белки с галактозидазой: [c.149] [c.157] [c.437] [c.107] [c.109] [c.129] [c.139] [c.139] [c.140] [c.140] [c.142] [c.158] [c.161] [c.161] [c.164] [c.173] [c.177] [c.179] [c.183] [c.187]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология