Плазмиды векторы с SP Т или промоторами

Генетические способы отбора требуют значительно меньших затрат труда, чем методы скрининга, что позволило разработать новые подходы, позволяющие проводить генетическую селекцию клонов, содержащих последовательности, гомологичные любой желаемой последовательности-зонду. Это дало возможность расширить применение этого метода, распространив его на задачи, обычно решаемые с помощью более трудоемких (и часто менее специфичных) методов скрининга. В общих чертах в основе всех этих подходов лежит следующее обстоятельство хотя в случае большинства специфических эукариотических последовательностей нельзя обеспечить генетическую селекцию в клетках Е. соИ, можно сконструировать пары векторов, позволяющие селектировать продукты гомологичной рекомбинации, обусловленной гомологией последовательностей между клонами. Такая селекция основана на том факте, что процессы, подобные репликации ДНК, транскрипции, мобилизации плазмид или упаковке ДНК в фаговые частицы, могут происходить только по is-схеме в отношении соответствующего регуляторного элемента (области начала репликации, промотора, сигнала мобилизации или упаковки). Чтобы исключить рекомбинацию между векторными последовательностями, нужно подбирать векторные пары, не обладающие взаимной гомологией (или в случае рекомбинации фагов без взаимной гомологии в пределах той области, которая определяется маркерами, используемыми для селекции). Соблюдение этого главного принципа лежит в основе и скрининга фаговых клонов с использованием рекомбинации между [c.77]

Основная цель экспериментов по клонированию генов, которые предполагается использовать в биотехнологии, — подбор условий для эффективной экспрессии в нужном организме-хозяине. К сожалению, сам факт встраивания того или иного гена в клонирующий вектор еще не означает, что этот ген будет экспрессирован. В то же время, чтобы получение коммерческого продукта было экономически оправданным, уровень его синтеза должен быть достаточно высоким. Для достижения эффективной экспрессии уже сконструировано много специфических векторов для этого проводились манипуляции с целым радом генетических элементов, контролирующих процессы транскрипции и трансляции, стабильность белков, секрецию продуктов из хозяйской клетки и т. д. Среди молекулярно-биологических свойств систем экспрессии наиболее важны следующие 1) тип промотора и терминатора транскрипции 2) прочность связывания мРНК с рибосомой 3) число копий клонированного гена и его локализация (в плазмиде или в хромосоме хозяйской клетки) 4) конечная локализация синтезируемого продукта 5) эффективность трансляции в организме хозяина 6) стабильность продукта в хозяйской клетке. [c.105]

Для получения больших количеств чужеродных белков с помощью рекомбинантных штаммов Е. соИ бьша сконструирована плазмида pPL 2833. Она содержит сильный промотор, селективный маркерный ген и короткий участок с несколькими уникальными сайтами для рестрицирующих ферментов (полилинкер), следующий непосредственно за промотором. Эффективность этого экспрессирующего вектора в осуществлении синтеза чужеродных белков в Е. соН можно еще [c.108]

К счастью, правильно спланировав эксперимент, можно минимизировать влияние метаболической перегрузки, оптимизировать выход рекомбинантного белка и повысить стабильность трансформированных хозяйских клеток. Например, нагрузку можно снизить, если использовать малокопийные плазмидные векторы. А еще лучше вообще отказаться от векторов и встроить чужеродную ДНК в хромосомную ДНК организма-хозяина. В этом случае не нужно заботиться об обеспечении стабильности плазмиды. Кроме того, клетке не приходится расходовать свои ресурсы на синтез ненужных продуктов, кодируемых маркерными генами устойчивости к антибиотикам. Синтез продуктов таких генов, входящих в состав плазмидных векторов наряду с генами-мишенями, является одной из основных причин метаболической перегрузки. Интеграция в хромосому особенно важна в тех случаях, когда используется сам рекомбинантный микроорганизм, а не синтезируемый им продукт. Уменьшению метаболической перегрузки помогает также применение сильных, но регулируемых промоторов. В таких случаях ферментацию проводят в две стадии. На первой из них, во время роста, промотор, контролирующий транскрипцию гена-мишени, выключен, а на второй, во время индукции, -включен. [c.128]

Для экспрессии клонированных эукариотических генов интенсивно используют обычные дрожжи Sa haromy es erevisiae. Тому есть несколько причин. Во-первых, это одноклеточный организм, генетика и физиология которого детально изучены и который можно выращивать как в небольших лабораторных колбах, так и в промышленных биореакторах. Во-вторых, выделены и охарактеризованы несколько сильных промоторов этих дрожжей, а для систем эндогенных дрожжевых экспрессирующих векторов могут использоваться природные, так называемые 2 мкм-плазмиды. В-третьих, в клетках [c.136]

Рис. 7.15. Двухвекторная система экспрессии. Клонированные гены (а и Р) кодируют субъединицы димерного белка ( Р). После одновременной трансфекции клетки двумя плазмидами в ней синтезируются обе субъединицы и собирается функциональный димерный белок. Оба вектора несут сайты инициации репликации, функционирующие в Е. oli (ori ) и в клетках млекопитающих (о/-/= ) маркерный ген (Amp ) для отбора трансформированных клеток Е. oli, эукариотический промотор (р) и сигнал полиаденилирования (ра), которые регулируют экспрессию селективного маркерного гена (СМ) и каждого из клонированных генов.

Для выделения растительных промоторов из некоторых видов растений использовали специализированные так называемые промотор-направленные векторы и систему трансформации на основе Ti-плазмид Agroba terium. Суть подхода состоит в следующем. Репортерный ген без промотора встраивают сразу за правой фланкирующей последовательностью вектора на основе Ti-плазмиды, и после переноса Т-ДНК в хромосому растения он оказывается в окружении растительной ДНК. Если Т-ДНК встроится в промоторный участок функционального гена, то произойдет транскрипция репортерного гена. Для идентификации растительных промоторов в качестве репортерного гена можно использовать ген [c.383]

Смысловые и антисмысловые конструкции, находящиеся под контролем 358-промотора вируса мозаики цветной капусты, были встроены в бинарный вектор на основе Ti-плазмид и введены в клетки растений. У трех из 133 смысловых трансформантов и трех из 83 антисмысловых цветки были белыми, что указывало на подавление экспрессии эндогенного гена халконсинтазы, [c.406]

Для получения ретровирусного вектора полноразмерную ДНК ретровируса встраивают в плазмиду, с помощью эндонуклеазного расщепления удаляют большую часть гена gag и гены pol и env, оставляя 5 "-концевой участок гена gag и 5 - и 3"-LTR, а затем рядом с / -областью встраивают терапевтический ген, транскрипция которого будет контролироваться 5"-LTR-промотором при необходимости можно встроить и маркерный селективный ген с собственным промотором (рис. 21.3). Такая конструкция позволяет экспрессировать оба клонированных гена, На основе этой схемы созданы различные ретровирусные векторы. Максимальный размер ДНК-вставки, которую может переносить ретровирусный вектор, - примерно 8 т. п. н. [c.488]

Рис. 21.8. Вектор на основе аденоассопиированного вируса (ААВ). Проведена котрансфекция клетки-хозяина, инфицированной аденовирусом-помощником, двумя плазмидами, одна из которых содержит терапевтический ген (ТГ), фланкированный инвертированными концевыми повторами (ITR) ААВ, а другая — гены ААВ, ответственные за репликацию гер) и формирование капсида ap), которые находятся под контролем промотора р), и последовательность полиаденилирования (ра). Высвободившиеся после лизиса частицы рекомбинантного ААВ и аденовируса разделяют центрифугированием, а оставшиеся аденовирусные частицы инактивируют нагреванием.

Клонированные гены, рекомбинантные белки, моноклональные антитела, плазмиды, промоторы, векторы, кДНК, моновалентные вакцины [c.535]

Экспрессирующий вектор (Expression ve tor) Плазмидный вектор, сконструированный таким образом, чтобы клонированный ген экспрессировался только в определенной фазе клеточного цикла и только в течение определенного времени. Для этого в плазмиду встраивают сильный регулируемый промотор. [c.564]

Если ген нужен для производства программируемого им белка, то с помощью аналогичных приемов его встраивают в специальным образом сконструированные плазмиды, в которых ген примыкает к эффективно работающему промотору РНК-полимеразы. При введении таких плазмид в соответствующие клетки последние начнут интенсивно нарабатывать информационную РНК, соответствующую этому гену, а с ее помощью и конечный продукт гена — белок. Векторы, используемые для этой цели, называют экспрессирующилт. Отбор клеток, которые экспрессируют встроенный ген, лучше всего вести непосредственно по накоплению продукта экспрессии в клопах, например используя радиоимму1Юанализ или иммуноферментный анализ с мечеными антителами к продуцируемому геном белку. [c.304]

Контроль вариации фаз зависит от состояния промотора, направляющего транскрипцию генов Н2 и гН1. Это было показано с помощью клонирования соответствующей регуляторной области на плаз-мидном векторе с использованием методов, описанных в гл. 9. При выращивании клеток Е.соИ, содержащих плазмиду со встроенной регуляторной областью, можно получить огромную популяцию идентичных молекул. Плазмидную ДНК очищают и линеаризуют с помощью рестриктазы со RI (рис. 15.24). Денатурация и отжиг цепей ДНК приводит к образованию гетеродуплексов, содержащих цепи из различных исходных плазмидных молекул. Некоторые из этих гетеродуплексных молекул содержат негибридизующийся участок протяженностью около 800 п.н. (рис. 15.24). Появление этого участка, как оказалось, вызвано тем, что в некоторых плазмидах произошла переориентация участка протяженностью 800 п. н. Это наблюдение позволило предложить модель механизма вариации фаз, согласно которой промотор генов Н2 и гН1 может находиться в одной из двух ориентаций ( флип или флоп ). В одной из них транскрипция с этого промотора приводит к образованию белков Н2 и гН1, При другой ориентации транскрипции этих генов не происходит (рис. 15.25). [c.201]

Возможности этих методов еще не до конца раскрыты. В частности, использование радиоактивных З -дезоксинуклеотидов существенно увеличивает точность секвенирования, но пока еще не все из них имеются в продаже. Секвенирование РНК облегчается при использовании систем с промоторами, работающими в двух направлениях (например, плазмид pGEM, векторов phages ript и blues ript). Это уменьщает количество генноинженерных манипуляций, необходимых для определения нуклеотидной последовательности обеих цепей. [c.37]

Известно два основных нути желаемая структура может быть образована в один этап, нанример, в результате рекомбинации в пределах короткого района гомологии — при введении последовательностей, содержащихся в селекционной плазмиде, в специфический участок космидного клона (рис. 3.3). Примером может служить подстановка энхансерных или промоторных последовательностей в участок, предшествующий гену, введение селективных маркеров или индикаторных генов (устойчивости к неомицину, хлорамфеникол-ацетилтрансферазы, р-га-лактозидазы) под контроль промотора, который несет космида, или создание случайных составных сегментов, образованных гомологичными генами, принадлежащими космиде и плазмиде. При необходимости может быть использован перенос в клетки-хозяева, непермиссивные для репликации одного из этих компонентов, что позволяет элиминировать независимо реплицирующиеся плазмиды, возникающие в результате вторичных рекомбинационных событий. Сходным образом селекционные плазмиды с последовательностями, гомологичными космидному вектору, используют для введения специфических последовательностей (например, маркеров, селектируемых в эукариоти- [c.85]

Какого бы типа векторные плазмиды ни использовались, для эффективного инициациирования тракскрипции необходимо, чтобы в их составе присутствовал дрожжевой промотор. Чаще всего используют гликолитические промоторы. Поскольку ферменты гликолиза, несмотря на то что они кодируются уникальными генами, составляют от 1 до 5% суммарного клеточного белка, можно было предположить (и зто оказалось верно), что промоторы соответствующих генов относятся к разряду сильных промоторов. Другое необходимое условие успешной экспрессии — это эффективное терминирование транскрипции. Дрожжевые клетки обычно узнают терминаторные последовательности млекопитающих, однако с точки зрения оптимизации системы имеет смысл ввести в вектор дрожжевой терминатор (рис. 7.1). Промотор и терминатор разделены уникальным сайтом рестрикции, что позволяет реализовать стандартный путь создания рекомбинантной конструкции с интересующим структурным геном. [c.215]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология