Блоттинг

Методы Нозерн- и Саузерн-блоттинга позволяют гибридизовать молекулы нуклеиновых кислот, предварительно фракционированные с помощью электрофореза [44] [c.239]

Метод также можно применять и для РНК. Для переноса РНК с агарозы в среду, пригодную для проведения гибридизации, его необходимо несколько видоизменить. Такой метод известен под названием Нозерн-блоттинга . [c.243]

Очень важной областью применения радиоавтографии является обнаружение радиоактивного ДНК-зонда после его гибридизации с препаратом ДНК, подвергнутым электрофоретическому разделению. К сожалению, провести гибридизацию в самом геле невозможно, поскольку зонд не может в него проникнуть. Поэтому ДНК после электрофореза переносят на нитроцеллюлозный или найлоновый фильтр по методу Саузерна (Саузерн-блоттинг) или с помощью элюции. Расположение молекул ДНК на фильтре в точности соответствует таковому в геле. Перенесенную на фильтр ДНК подвергают [c.65]

Рис. 4-72. Методы Нозерн - и Саузерн -блоттинга. После электрофоретического фракционирования смеси молекул ДНК или РНК в агарозном геле проводят перенос различных фрагментов нуклеиновых кислот на лист нитроцеллюлозы или найлона ( блоттинг ). Этот лист затем инкубируют с радиоактивным ДНК-зондом в течение длительного времени в условиях, способствующих гибридизации. Затем лист тщательно промывают, гак что радиоактивно меченными оказываются лищь те фрагменты, которые гибридизуются с ДНК-зондом. На радиоавтографе,

Рис. 25.32. Некоторые этапы анализа ДНК при генетическом скрининге. В процессе Саузерн-блоттинга денатурированная (одноцепочечная) ДНК переносится из агарозного геля на нитроцеллюлозный или нейлоновый фильтр. В настоящее время бумажные полотенца обычно не употребляются вместо этого используют метод электро-блоттинга или вакуумного блоттинга.

Перенос (блоттинг) на нитроцеллюлозу [c.242]

ДНК в геле сначала переводят в одноцепочечное состояние (денатурируют) путем нагревания. Затем ее переносят на нитроцеллюлозный или нейлоновый фильтр с помощью блоттинга, при этом получается точная копия геля. Стопка бумажных полотенец действует как фитиль, который протягивает буфер через губку, гель и фильтр. При этом ДНК прочно прикрепляется к фильтру. [c.259]

Перенос ДНК из геля на фильтр носит название Саузерн-блоттинга в честь Эдвина Саузерна, который изобрел этот метод. Использующиеся в литературе термины Нозерн-блоттинг и Вестерн-блоттинг относятся к переносу РНК и белков соответственно. Эти названия - в переводе северный и западный -не имеют никакого отношения к сторонам света и были придуманы остроумными коллегами Саузерна (Southern - южный). Тем самым они как бы напутствовали Саузерна на разработку новых методов переноса макромолекул, а также четко обозначили, о переносе каких макромолекул идет речь. Кроме того, все увидели, что шутить умеют не только физики, но и биологи. [c.65]

Блоттинг ДНК по саузерну — процедура переноса денатурированной ДНК из агарозного геля на нитроцеллюлозный фильтр для гибридизации с комплементарными нуклеотидными последовательностями. [c.459]

Блоттинг РНК — перенос РНК из агарозного геля на нитроцеллюлозный фильтр для последующей гибридизации с комплементарной ДНК. [c.459]

Рис. 19.6. Блоттинг по Саузерну позволяет осуществить прямое выделение фрагментов ДНК, соответствующих специфическому зонду, из смеси рестриктов ДНК генома.

Рис. 19.7 При блоттинге по Саузерну фрагменты ДНК переносят с агарозного геля на нитроцеллюлозный фильтр.

БЛОТТИНГ ДНК ПО САУЗЕРНУ. Процедура переноса денатурированной ДНК из агарозного геля на нитроцеллюлозный [c.519]

II тонкослойных пластинках), уступившему было своп позиции электрофорезу в гелях и ЖХВД. Наиболее интересные результаты достигаются при сочетании такого электрофореза с ТСХ в виде двумерного фракционпрования. Аналогичное сочетание с использованием электрофореза в геле возможно, но затруднительно ввиду сложности количественного переноса вещества с геля на пластинку. Впрочем, впечатляющее развитие в последнее время методов переноса веществ из гелей на фильтры ( блоттинга ) может привести к пересмотру этого утверждения. Ниже мы рассмотрим целый ряд примеров использования двумерного фракционирования с участием электрофореза, не фиксируя внимания на общих закономерностях последнего, поскольку он был подробно рассмотрен нами (для гелей) в одной из предыдущих книг серии, а отмечая лпшь те особенности, которые характерны именно для электрофореза на твердых носителях. [c.458]

Рис. 18.11. Плазмидный вектор, содержащий кластер генов хитиназы риса и кластер генов устойчивости к гигромицину, использовавщийся для трансформации протопластов риса. Трансформацию осуществляли обработкой протопластов полиэтиленгликолем в присутствии плазмидного вектора. Затем отбирали клетки, устойчивые к гигромицину, и проводили тестирование клеток на наличие генов хитиназы с помощью гибридизации по Саузер-ну и на наличие самой хитиназы методом Вестерн-блоттинга. Далее из клеток регенерировали целые растения.

Двумерный электрофорез в полиакриламидном геле может быть также использован для локализации участков ДНК, отвечающих 5 - и З -концевым последовательностям и точкам внут-)имолекулярного переплетения ядерной или вирусной РНК 116]. С этой целью продукт гибридизации РНК и ДНК обрабатывают эндонуклеазой S1, специфичной по отношению к одноцепочечным нуклеиновым кислотам, и полученные гибриды комплементарных фрагментов ДНК и РНК разделяют в соответствии с их размерами с помощью гель-электрофореза. Затем в денатурирующих условиях проводят электрофорез во втором направлении, с тем чтобы определить размер образующихся одноцепочечных фрагментов ДНК. Специфические последовательности обнаруживают с помощью блоттинга по Саузерну и последующей молекулярной гибридизации [116]. Одноцепочечные фрагменты ДНК можно легко разделить с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в щелочной среде. Денатурированные образцы подвергают гель-электрофорезу в буфере, содержащем 30 мМ NaOH и 2 мМ ЭДТА [117]. По своему поведению в этих условиях электрофореза такие фрагменты похожи на одноцепочечные фрагменты РНК (разд. 10.5.2). [c.187]

Бринстер и др. инъецировали ген тимидинкиназы HSV под контролем промотора гена метал-лотионеина-1 и обнаружили, что у одной из полученных трансгенных мышей синтезировалось больше тимидинкиназы HSV в клетках печени и почек, чем у трех других, синтезировавших этот фермент лишь в небольшом количестве. Кроме того, восемь других трансгенных животных несли ген тимидинкиназы HSV, но не синтезировали активного фермента. По данным Саузерн-блоттинга, у всех трансгенпых мышей введенная ДНК присутствовала в большом числе копий. [c.428]

Блоттинг (Blotting) Перенос разделенных молекул из одной среды (например, геля) на твердый носитель (бумагу, нитроцеллюлозный фильтр). [c.545]

Вестерн-блоттинг (Western blotting) Перенос белковых молекул, разделенных с помощью гель-электрофореза, на твердую подложку. [c.545]

Нозерн-блоттинг (Nothem blotting) Перенос молекул РНК, подвергнутых элктроферезу, с геля на твердую подложку (нитроцеллюлозный или найлоновый фильтр) с последующей ДНК—РНК-гибридизацией. [c.554]

Цель данного этапа — выявить в каком из фрагментов находится интересующая нас последовательность ДНК. Это делают с помошью генного зонда. Поскольку зонд плохо продвигается в геле, используют метод, называемый Саузерн-блоттингом (Эдвард Саузерн разработал этот метод в 1975 г.). Последовательность операции представлена на рис. 25.32 (см. также раздел о генетической дактилоскопии, 25.7.12). [c.259]

Однако при наличии специфического зонда в пятне рестриктов можно обнаружить соответствующие ему последовательности. Последовательность операций такого метода приведена на рис. 19.6. Ключевой момент-денатурация ДНК с образованием одноцепочечных фрагментов, которые переносят из агарозного геля на нитроцеллюлозный фильтр, где они иммобилизуются. Процесс переноса ДНК несколько похож на промокание (по-английски-блоттинг), и в разговорной речи этот термин используется для его обозначения. При работе с ДНК такой метод известен под названием блоттинга по Саузерну (Southern blotting) (по фамилии автора метода). [c.243]

При расщеплении двух идентичных генов, содержащих 5 - и З -концевые участки, образуются различающиеся фрагменты, поскольку сайты рестрикции находятся в различных участках фланкирующей ДНК. Фрагменты идентифицируют с помощью блоттинга ДНК после электрофореза и гибридизации ее с меченой кДНК-зондом. Так как каждый фрагмент включает оба конца гена, он гибридизуется с кДНК-зоидами, специфичными по отнощению как к 5 -, так и к З -концевым последовательностям. [c.252]

Рис. 26.7. При анализе ядерной РНК с помощью блоттинга по Нозерну и гибридизации с зондом, содержащим овомукоидные последовательности, обнаруживается ряд дискретных предшественников мРНК.

Что происходит с удаленными интронными участками Эксперименты по гибридизации с популяцией ядерных РНК свидетельствуют о том, что концентрация овальбуминовых интронных последовательностей примерно в 10 раз ниже, чем концентрация последовательностей экзонов. Возможно, это означает, что удаленные из молекул интроны довольно быстро разрушаются, а предшественники, идентифицируемые при Нозерн-блоттинге или при электронно-микроскопическом анализе, представляют собой популяцию более стабильных ядерных молекул. Все промежуточные продукты, которые подвергаются более быстрому процессингу, будут присутствовать в относительно небольших количествах, так что обнаруживаемые предшественники-это промежуточные продукты, процессинг которых происходит медленно и которые поэтому присутствуют в более высоких концентрациях. [c.324]

При расщеплении хроматина ДНКазой I он деградирует в конце концов до кислоторастворимого материала (очень мелких фрагментов ДНК). За общим ходом реакции можно проследить, определяя долю ДНК, перешедшей в кислоторастворимую фракцию. За судьбой же отдельного гена можно проследить, исследуя количество нерасщепившейся ДНК по ее способности вступать в реакцию со специфическим зондом (для этого обычно используются метод рестрикционного расщепления, блоттинг и гибридизацию). Схема такого опыта приведена на рис. 30.7. Основной подход заключается в том, что потеря определенной полосы свидетельствует о том, что именно этот участок переварен ферментом. [c.381]

Для анализа РНК. кодирующих альбумин, с помощью ДНК-зонда используется метод Нозерн-блоттинга. На первом этапе с помощью гель-электрофореза, фракционируют интактные молекулы РНК дефектных и контрольных клеток печени и пол чают набор полос. Для гого чтобы молекулы РНК, содержащиеся в геле, сделать более доступными ДНК-зонду, осуществляют перенос (блоттинг) фракционированных молекул РНК из геля на лист нитроцеллюлозы. На следующем этапе лист нитроцеллюлозы инкубируют с раствором, содержащим меченый ДНК-зонд. Полосы РНК, гибридизующиеся с зондом, выявляют методом радиоавтографии (рис. 4-72). Известно, что скорость движения молекул нуклеиновых кислот в геле зависит от их размера при электрофорезе малые молекулы перемещаются быстрее, чем большие. Сравнивая [c.239]

Для анализа структуры гена альбумина дефектных мыщей был использован метод Саузерн-блоттинга. В данном случае вместо РНК анализируется ДНК Изолированную ДНК сначала обрабатывают рестрицирующими нуклеазами, затем полученные фрагменты разделяют по размеру гель-электрофорезом и выявляют комплементарные ДНК-зонду альбумина с помощью переноса и гибридизации, как это описано для РНК (см. рис. 4-72). Повторяя эту процедуру с различными рестрицирующими нуклеазами, можно получить детальную рестрикционную карту генома в участке альбуминового гена (см. разд. 4.6.2). Анализируя эту карту, можно ответить на вопрос, несет ли альбуминовый ген у дефектных животных перестройки, например, делеции или инсерции коротких фрагментов ДНК. [c.240]

В некоторых случаях крайне желательно экстрагировать разделенные в агарозном геле фрагменты. Они могут понадобиться для исследования химическими и физическими методами, а также для установления деталей структуры рестрикционным анализом, определения последовательности оснований в ДНК, гетеродуплексно-го анализа и гибридизации с использованием эндонуклеазы [6] или блоттинга методом Саузерна [28]. Приводимая ниже методика [11] позволяет экстрагировать с хорошим выходом всевозможные интактные, биологически активные молекулы ДНК непосредственно из полос, которые они образуют в агарозном геле. Для осуществления этой операции нужен выпускаемый промышленностью препарат агаразы ( albio hem, La Jolla, alif., номер по каталогу 121811)—фермента, расщепляющего агарозу. [c.144]

Предварительно вырезанный лист нитроцеллюлозы ) вымочите в 20XSS > в течение по меньщей мере 5 мин и соберите аппарат для слот )- или дот-блоттинга" согласно инструкции фирмы-изготовителя. [c.348]

Биохимия человека Т.2 (1993) -- [ c.43 ]

Биохимия человека Том 2 (1993) -- [ c.43 ]

Практическая химия белка (1989) -- [ c.0 ]

Искусственные генетические системы Т.1 (2004) -- [ c.0 ]

Гены и геномы Т 2 (1998) -- [ c.278 ]

Молекулярная биология клетки Сборник задач (1994) -- [ c.0 ]

Генетическая инженерия (2004) -- [ c.0 ]

Молекулярная биология клетки Т.3 Изд.2 (1994) -- [ c.239 ]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология