Регуляторные последовательности эукариотического генома

Инициация и регуляция транскрипции ДНК у эукариот с участием РНК-полимеразы в большей степени, чем у прокариот, зависит от множества других белков — факторов транскрипции, взаимодействующих с дискретными участками ДНК, образующих сложный эукариотический про.мотор. В районе промотора, прилегающего к сайту инициации транскрипции (кзп-сайту), обнаружены участки с характерными нуклеотидными последовательностями (мотивами), которые оказывают цис-действие на экспрессию близлежащего гена. Эти элементы могут взаимодействовать с РНК-полимеразой и другими белками-факторами транскрипции. Разные ядерные белковые факторы транскрипции, представляющие собой регуляторные белки, способны связываться с теми или иными нуклеотидными последовательностями ДНК, оказывая тем самым влияние На экспрессию разных генов. Такие белки, способные к диффузии [c.195]

Экспрессия любого эукариотического гена с целью получения нативного белка требует использования структурной части гена в сочетании с соответствующими нуклеотидными последовательностями, которые распознаются ферментами клетки-хозяина как эффективные сигналы инициации транскрипции, трансляции, терминации трансляции и, возможно, терминации транскрипции. Сконструированный нужным образом гибридный ген, содержащий регуляторную область бактериального происхождения и структурную область гена человеческого интерферона, встраивают в плазмиды, способные автономно реплицироваться и стабильно поддерживаться в процессе роста микроорганизмов (рис. 38). [c.193]

Как показало исследование структуры и функции эукариотических генов, гены про- и эукариот существенно различаются по сложности коротких последовательностей ДНК, которые регулируют транскрипцию (рис. III.3). В прокариотических генах выявлено три разных типа регуляторных эле- [c.7]

Как обсуждалось в гл. 15, регуляция прокариотических генов осуществляется за счет взаимодействия специализированных регуляторных белков с регуляторными участками последовательности ДНК. Теперь мы знаем, что это в равной мере относится и к регуляции эукариотических генов. Применение методов работы с рекомбинантными ДНК позволило выделить и изучить целый ряд индивидуальных генов и тесно сцепленных с ними регуляторных последовательностей из различных типов эукариотических клеток и их вирусов. В результате таких исследований удалось значительно расширить круг представлений о структуре кодирующих и некодирующих участков эукариотических ДНК и РНК-транскриптов. [c.207]

В то же вре.чя многие регуляторные белки эукариот, как и у прокариот, составляют ничтожную долю всех белков. Регуляторные последовательности эукариотических генов иногда удалены от промотора на значительное расстояние (энхансеры, см. гл. X, раздел 2) и расположены впереди или позади него. Эго затрудняет поиск белков, узнающих определенные последовательности ДНК-ДИК в хроматине свернута в спираль с шагом около 80 и.о., и сайт узнавания может быть составлен из фрагментов разных участков, разнесенных в первичной структуре на эту величину. Поэтому изучение и моделирование механизма узнавания ДНК в хроматине требуют разработки совершенно новых подходов. [c.250]

Фаговые векторы. Космиды. ВАС- и YA -векторы. Векторы на основе бактериальных плазмид широко используются для клонирования, но у них есть один важный недостаток — небольшая емкость. В таких векторах можно клонировать фрагменты в среднем не более 7—8 т. н. п., а последовательности эукариотических генов гораздо длиннее (в среднем IО—25 т. н. п). Кроме того, для изучения регуляторных последовательностей, находящихся за пределами кодирующей части генов, необходимо клонировать еще более протяженные области генома. Оказалось, что для клонирования таких фрагментов плазмидные векторы не подходят. Дело в том, что плазмиды, содержащие большие вставки хромосомной ДНК (более 8 т. н. п.), нестабильны и при репликации постепенно уменьшаются в размере в результате делеций нуклеотидов чужеродной ДНК. [c.40]

Отдельные элементы регуляторной области генов, например, энхансеры, могут располагаться на значительном (>60 т.п.о.) расстоянии от структурной части гена - как перед ней, так и позади нее или даже в ней самой. В самой же структурной части большинства эукариотических генов кодирующие последовательности нуклеотидов экзоны) перемежаются протяженными некодирующими последовательностями нитронами). Суммарный размер нитронов у высших организмов как правило, многократно превышает суммарный размер экзонов конкретных генов [6-8]. Уже исходя из этого факта, можно сделать вывод о том, что геном любого эукариотического организма содержит не только последовательность нуклеотидов с генетической информацией о белках и нуклеиновых кислотах, но и большое количество последовательностей нуклеотидов, не несущих такой информации. [c.14]

Определение эукариотического гена. Хотя строение прокариотических и эукариотических генов в принципе одинаково, молекулярные детали их структуры существенно различаются. Новое определение эукариотического гена, возможно, поможет обобщить существо этих различий. Следует признать, что ни одно конкретное определение эукариотического гена не может полностью удовлетворить всех и быть приемлемым во всех случаях. Определение, предложенное нами, основывается на молекулярном строении генов, выполняющих разнообразные функции в разных эукариотических организмах. Оно учитывает особенности местоположения и типов элементов последовательности ДНК, влияющих на экспрессию гена, а также то, что изменение фенотипических признаков обусловлено изменением как кодирующих последовательностей, так и регуляторных элементов. [c.24]

В основе регуляции экспрессии генов вирусов млекопитающих лежат те же принципы, что и в основе регуляции экспрессии клеточных генов. Как и промоторы большей части эукариотических генов класса II, промоторы вирусов состоят из проксимальных регуляторных элементов, как правило, входящих в последовательность, непосредственно окружающую точку начала транскрипции и простирающуюся до пары оснований- 100, и дистальных регуляторных элементов, чаще всего расположенных между парами оснований —100 и —300, которые обеспечивают экспрессию гена, специфичную для данной ткани или данной стадии развития организма (рис. 8.27). Регуляторные последовательности, находящиеся внутри единицы транскрипции или за ней, насколько известно, не входят в состав вирусных промоторов. [c.48]

Как правило, прокариотические гены состоят из небольшого регуляторного участка (100—500 п.н.) и большого кодирующего белок сегмента (500— 10000 п. н.). Часто несколько генов контролируются одним и тем же регуляторным элементом. Большинство генов млекопитающих имеют более сложную структуру. Кодирующие области эукариотических генов прерываются и чередуются с некодирующими участками. Эти участки, будучи транскрибированными, удаляются в процессе созревания первичного транскрипта. Кодирующие области (остающиеся в зрелой мРНК) называются экзонами. Нуклеотидные последовательности ДНК, находящиеся между экзонами, называются интронами (рис. 36.1). Интро-ны удаляются из первичного транскрипта до того. [c.36]

Для обеспечения регулируемой тканеспецифической экспрессии рекомбинантных генов в соматических клетках животных и растений в составе векторов используют энхансеры, которые избирательно стимулируют транскрипцию в соответствующих тканях и не оказывают такого действия на гены в тканях, клетки которых не экспрессируют необходимые регуляторные белки. Кроме того, популярным становится введение в экспрессирующие эукариотические векторы пограничных последовательностей нуклеотидов, фланкирующих клонируемые гены, которые помогают обеспечивать экспрессию рекомбинантных генов, сводя к минимуму эффект их положения в хромосомах соматических клеток. [c.111]

Использование всех этих методик позволило идентифицировать регуляторные области эукариотических генов даже в отсутствие каких-либо прямых данных о связывающихся с ними белках-регуляторах. Оказалось, что участок ДНК вблизи сайта инициации синтеза РНК чрезвычайно важен для успешной транскрипции (элемент, расположенный перед промотором). Обычно он насчитывает в длину около 100 нуклеотидных пар и включает в себя ТАТА-бокс. Еще большее удивление вызвал тот факт, что для эффективной транскрипции нужны последовательности, довольно значительно удаленные от промотора (энхансеры). Как и в случае сайта связывания белка п1гС у бактерий, энхансеры у эукариот воздействуют на транскрипцию, находясь на расстоянии. [c.192]

На первый взгляд разработка любой эукариотической системы экспрессии представляется относительно простой процедурой, состоящей в подборе соответствующих регуляторных последовательностей, встраивании их в вектор в определенном порядке и клонировании гена-мишени таким образом, чтобы обеспечивалась его эффективная экспрессия. На практике же создание первого поколения эукариотических экспрессирующих векторов оказалось весьма кропотливым делом, основанным на методе проб и ошибок. До появления работы Муллигана, Хоуарда и Берга [c.146]

ЭТОМ чужеродная ДНК, не имеющая этих опознавательных метильных групп, разрущается рестриктирующими эндонуклеазами. В эукариотических ДНК присутствует большое число высокоповторяющихся коротких последовательностей, меньшее число более длинных умеренных повторов, которые, как полагают, играют регуляторную роль, и ряд уникальных (неповторяющихся) участков, представляющих собой, видимо, структурные гены. Эукариотические гены содержат вставочные нетрансли-руёмые нуклеотидные последовательности, называемые интронами, которые вставлены между транслируемыми участками, называемыми экзонами. С помощью недавно разработанных методов были определены нуклеотидные последовательности ряда генов и вирусных ДНК. [c.891]

Рис. 3-38. Пример широко распространенной в эволюции белков перетасовки блоков белковых последовательностей. Участки белка, обозначенные окрашенными геометрическими фигурами, являются эволюционно родственными, но не идентичными. А. Бактериальный САР-белок состоит из двух доменов один из них (закрашенный треугольник) связывается со специфической последовательностью ДНК, второй - связывает сАМР (см. рис. 3-33). ДНК-связываюший домен родствен ДНК-связываюшим доменам многих других белков регуляторных генов, включая белки 1ас-репрессор и его-репрессор. Кроме того, две копии сАРМ-связывающего домена обнаружены в эукариотических киназах, регулируемых связыванием циклических нуклеотидов. Б. Представлены два домена, состоящие примерно из 40 аминокислот, каждый из которых встречается в трех больших белках позвоночных. Например, рецептор липопротеина низкой плотности (ЛНП) - это трансмембранный белок из 839 аминокислотных остатков, ответственный за выведение холестерола из клеток. Он содержит много доменов, имеющихся и в других белках, в частности, семь копий цистеин - богатого домена (светлые кружки), участвующих в связывании ЛНП, и три копии такого же размера (окрашенные

Некоторые общие особенности регуляции экспрессии эукариотических генов, рассмотренные в предшествующих разделах, распространяются и на процессы регуляции гемоглобиновых генов, которые зависят от стадии развития организма. С этой точки зрения наиболее подробно изучались кластеры куриных глобиновых генов, что связано в первую очередь с доступностью соответствующих гемоглобин-проду-цирующих клеток на любой стадии развития. Установлено, что каждый из кластеров располагается в хроматиновом домене, который у гемо-глобин-продуцирующих клеток более чувствителен к действию ДНКазы I, чем у клеток других тканей. Более того, в хроматине гемоглобин-про-дуцирующих клеток обнаружены участки, гиперчувствительные к ДНКазе I, расположенные перед сайтами инициации транскрипции активно транскрибируемых глобиновых генов. В хроматине клеток тканей иного типа аналогичные участки не обнаруживаются. В гемоглобин-продуцирующих клетках взрослой особи инактивация эмбриональных глобиновых генов коррелирует с исчезновением гиперчувствительных участков, предшествующих сайтам инициации транскрипции этих генов. Наблюдается также пониженный уровень метилирования сайтов СО внутри и вблизи активно транскрибируемых последовательностей. Инактивация эмбриональных генов, напротив, сопровождается повышением уровня метилирования соответствующих сайтов. Таким образом, имеются характерные различия в структуре хроматиновых доменов, содержащих кластеры а- и Р-подобных глобиновых генов, в клетках эмбриона и взрослого организма. Поскольку на различных стадиях развития продукция гемоглобина обеспечивается клетками определенного типа, можно полагать, что связанная с развитием регуляция глобиновых генов сопровождается поэтапным установлением в этих клетках альтернативных вариантов структуры соответствующих областей хроматина. Безусловно, многое еще предстоит узнать о природе регуляторных молекул, ответственных за установление различных вариантов хроматиновой структуры, а также о том, на какие последовательности ДНК действуют эти регуляторные молекулы. [c.232]

В тех случаях, когда требуется определить, какая именно часть эукариотического гена ответственна за регулирование его экспрессии, предполагаемые регуляторные последовательности ДНК этого геиа можно присоедииить к кодирующей последовательности другого гена, выбранного с гаким расчетом, чтобы в нем был закодирован какой-нибудь легко обнаруживаемый фермент-маркер, в норме в эукариотических клетках отсутствующий. Чаще всего в качестве такого фермеита-маркера используется бактериальный белок хлорамфеникол-ацетил-трансфераза (ХАТ) Полученную рекомбинантную молекулу ДНК вводят в эукариотическую клетку, чтобы выяснить, действительно ли предполагаемые регуляторные последовательности стимулируют экспрессию геиа ХАТ. Проще всего сделать это, если трансфицировать [c.337]

Первое доказательство биологической значимости сайтов, сверхчувствительных к нуклеазе, было получено в экспериментах с вирусом 8У40. Его хромосома помимо кольцевой ДНК содержит гистоны, продуцируемые клеткой-хозяин ом. В составе этой хромосомы имеется участок длиной 300 нуклеотидных пар, который свободен от нуклеосом и быстро разрушается под воздействием ДНКазы . Этот участок расположен очень близко от последовательностей ДНК, с которых начинается как репликация ДНК вируса, так и синтез его РНК. Здесь же локализуются и несколько сайт-специфических ДНК-связывающих белков, которые защищают лишь небольшой участок этой молекулы, по-видимому, совершенно лишенный нуклеосом, от нуклеазной деградации. Аналогичным образом, многие участки хроматина в клетке, обладающие гиперчувствительностью к ДНКазе, расположены в регуляторных областях генов (рис. 9-25) в клетках, где эти гены активны, таких сайтов больше, нежели в других клетках. Полагают, что за удаление нуклеосом ответственны сайт-специфические ДНК-связывающие белки, которые принимают участие в регуляции эукариотических генов (см. рис. 9-27). [c.113]

Принципиальное различие схем, приведенных на рис. 10-43, говорит о том, как мы еще далеки от понимания процесса перехода хроматина из неактивного в активное состояние. Неизвестно, сколько существует форм хроматина и какие именно его структурные особенности приводят к тому, что некоторые области более конденсированы, чем другие. Исходя просто из функции хроматина, невозможно объяснить, почему аминокислотные последовательности гистонов (в особенности НЗ и Н4) оказываются такими консервативными. Недавно выявлены некоторые химические свойства, присущие только активному хроматину (см. разд. 9.2.10), а для отделения нуклеосом (и связанных с ними последовательностей ДНК) активного хроматина от остальных нуклеосом стали использовать моноклоналные антитела. Применяя эти методы при работе с хроматином, выделенными из трансгенных животных, в принципе возможно отличить регуляторные области, ответственные за активацию хроматина, от других участков, что несомненно должно способствовать пониманию того, как контролируются эукариотические гены. [c.215]

Регуляторные части генов, а также продукты их экспрессии, мРНК и белки, распознаются соответствующими ферментными системами организма и обеспечивают упорядоченную экспрессию структурной части гена. При этом регуляторные участки генов и промежуточных продуктов их экспрессии, как правило, высокоспецифичны в отношении своих природных генетических эффекторов (РНК-полимераз, рибосом, факторов транскрипции и трансляции, белковых факторов сплайсинга, ферментов, осуществляющих посттрансляционные модификации полипептидов, и т.п.), и чаще всего они не могут эффективно функционировать в гетерологичном генетическом окружении. Очевидно, что при конструировании высокоэффективных экспрессирующих векторов необходимо, прежде всего, учитывать особенности структуры регуляторной части рекомбинантного гена, исходя из того, в каких генетических условиях клонированный ген будет экспрессироваться. Однако не только регуляторные последовательности генов являются препятствием для высокоэффективной экспрессии чужеродных рекомбинантных генов. Как уже было отмечено, структурные части генов про- и эукариот фундаментально отличаются друг от друга по наличию у последних внутри генов интронов. Следовательно, гены эукариот не могут эффективно экспрессироваться в бактериальных клетках, поскольку у прокариот отсутствуют соответствующие системы сплайсинга. Кроме того, у предшественников эукариотических мРНК не может осуществиться в бактериальных клетках и правильный процессинг 3 - и 5 -концевых некодирующих последовательностей. Даже такой [c.106]

К наиболее полезным для анализа модификациям в структуре гена относятся замена одного нуклеотида или группы нуклеотидов, делеции или вставки нескольких нуклеотидов или протяженных участков ДНК и перестройки внутри гена. Ниже мы обсудим, каким образом эти модификации используются для идентификации регуляторных последовательностей, которые обеспечивают правильную экспрессию гена и отвечают за его тканеспецифичную и зависящую от времени регуляцию. Кроме того, изучение новых генов, образующихся при слиянии частей различных генов, очень облегчает идентификацию последовательностей, ответственных за правильную экспрессию. Например, слияние промотора SV40 и различных его производных с последовательностями, кодирующими легко идентифицируемые бактериальные или эукариотические клеточные белки, позволяет выяснить, какие последовательности промотора обеспечивают правильную инициацию, эффективность и регуляцию транскрипции гена SV40. Аналогичные химерные гены, содержащие, например, промоторы генов инсулина или эластазы, слитые с областью, кодирующей Т-антиген SV40, позволяют идентифицировать элементы, ограничивающие экспрессию генов инсулина или эластазы исключительно Р-клетками островков Лангерганса или ацинарными клетками соответственно. Для применения методов обратной генетики необходимо, чтобы существовал один или лучше несколько способов определения фенотипического проявления измененного гена. Соответствующие бесклеточные системы, с помощью которых можно определять эффективность транскрипции нормальных и модифицированных генов, а также изучать процессинг или трансляцию РНК, дают прекрасную возможность для анализа функции генов и последствий отдельных изменений в них. Трансфицируя нормальные и модифицированные гены с помощью [c.20]

Семейства повторяющихся последовательностей как регуляторы экспрессии генов. Напомним, что в отличие от прокариот, у которых родственные гены, имеющие отношение к определенным метаболическим реакциям, обычно сцеплены и регулируются с помощью одного оперона (разд. 3.11), родственные эукариотические гены обычно диспергированы. Например, гены а- и Р-глобинов расположены на разных хромосомах, но должны экспрессироваться согласованно. Другими словами, весь набор диспергированных генов в конкретной ткани или на определенной стадии развития организма должен экспрессироваться одновременно. Такая координация возможна, если у всех членов генного кластера имеется общий регуляторный элемент. В таком случае включать или выключать весь набор генов может одна эффекторная молекула, взаимодействующая с одинаковыми диспергированными регуляторными элементами. Контроль за экспрессией генов может осуществляться на уровне ДНК путем регуляции транскрипции или же на уровне РНК. Например, в гетерогенной ядерной РНК, по-видимому, сохраняется картина распределения повторов, характерная для геномной ДНК, и тогда координация регуляции может осуществляться с помощью контроля созревания первичных транскриптов с образованием мРНК. В то же время копии повторяющихся последовательностей могут содержаться и в зрелых мРНК, и тогда регуляция генной экспрессии будет происходить на уровне трансляции. [c.205]

Для более подробной характеристики глобипового гена необходимо получить больпюе количество его ДНК. Для этого клонируют к-ДНК в каком-нибудь векторе, ианример, в бактериальной плазмиде. Затем сравнивают фрагменты геномной ДНК, содержащие глобиновый ген, и клонированную к-ДНК, соответствующую м-РНК. Оказалось, что фрагменты геномной ДНК значительно больше, чем к-ДНК. В р-гемоглобиповом гене были выявлены две вставочные последовательности (интроны), которые разделяют три разные кодирующие области — эк-зоны. (Исследования многих других эукариотических генов, показали, что наличие интронов является правилом для большинства из них). Выяснилось также, что ген р-гемоглобина относится к уникальным последовательностям. Кроме того, были найдены псевдогены, имеющие мутации в колирующих и фланкирующих, регуляторных участках. Они называются псевдогенами, т.к. с них не идет транскрипция. [c.71]

В эукариотических генах, кодирующих мРНК, обнаружены два типа i/wi-регуляторных последовательностей ДНК-промоторы и энхансеры ( уси-лнтели У Промоторы обычно располагаются непосредственно перед сайтом, в котором начинаегся [c.141]

Белок TF 1П А был первым эукариотическим регуляторным полипептидом транскрипции с известной аминокислотной последовательностью, для которого удалось построит доменную структурную модель. В этом белке выявлены 9 повторяющихся, но отличающихся друг от друга доменов — пальцев , каждый из которых включает около 30 аминокислот. Домены содержат инвариантные-участки, включающие два цистеиновых и два гистидиновых остатка, связанных с ионом цинка (рис. 115). Концы разных пальцев (петли) несут варьирующие аминокислотные остатки, среди которых встречаются положительно заряженные, которые, по-видимому, способны легко взаимодействовать с ДНК. Как оказалось, подобная структура регуляторного белка закодирована в ряде других генов, кодирующих регуляторные белки эукариот. Так, ген Kruppel (калека), контролирующий развитие дрозофилы, кодирует белок, содержащий четыре подобных домена. Такие домены обнаружены и в белках — рецепторах гормонов. Предполагается, что выступающие связывающиеся с ДНК разные пальцы, соединенные друг с другом гибкими мостиками, осуществляют сразу несколько контактов с ДНК. Такая модель строения TF П1 А позволяет предполо- [c.211]

Последовательность оснований длиной 6 — 8 нуклеотидов, расположенная непосредственно перед инициирующим кодоном АУГ у Е. соИ, определяет эффективность процесса трансляции. Эта последовательность представляет собой участок связывания мРНК с рибосомой, и его сдвиг в ту или иную сторону способен уменьшать эффективность трансляции мРНК. По имени исследователей, идентифицировавших этот участок, он был назван последовательностью Шайн-Дальгарно. Обычно эту последовательность включают в состав самого вектора вместе с инициирующим кодоном на нужном расстоянии. При экспрессии векторов такого типа образуется гибридный белок, в котором несколько N-концевых аминокислотных остатков происходят от источника регуляторных элементов и инициирующего кодона прокариотического гена. Такие гибридные белки часто более стабильны обработка их химическим или ферментативным способом приводит к вьщелению эукариотической части белка. [c.123]

В многоклеточных организмах среднее число регуляторных сайтов для одного гена минимум равно пяти положительные регуляторные белки связываются со своими специфическими последовательностями в структуре ДНК (вероятнее всего, посредством водородных связей между амидной группой Глн или Асн и пуриновыми и пиримидиновыми основаниями нуклеотидов). Следует указать еще на один момент, почему эукариотическая клетка использует положительные механизмы регуляции экспрессии генов. Подсчитано, что в геноме человека содержится около 100000 генов, соответственно каждая клетка при отрицательном механизме регуляции могла бы синтезировать 100000 разных репрессоров, причем в достаточных количествах. При положительном механизме регуляции большинство генов в принципе неактивно, соответственно молекула РНК-полимеразы не связывается с промотором и клетка синтезирует ограниченный и избирательный круг активаторных белков, необходимых для инициации транскрипции. [c.538]

Рассмотренный подход эффективен в отношении как эукариотических клеток, так и бактерий. В случае эукариот обращенный ген соответствует нормальному гену, ориентированному противоположным образом. При некоторых способах регуляции экспрессии генов у бактерий РНК осуществляет регуляторную функцию благодаря своей комплементарности с последовательностью РНК-мишени. Регуляция может происходить на этапе репликации ДНК (гл. 33) или транскрипции (гл. 36). Направленную регуляцию можно осуществлять с помощью малой РНК, комплементарной 5 -концу мРНК-мишени. [c.341]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология