Белки, денатурация кинетические исследовани

Кинетическое изучение таких реакций (если они протекают достаточно медленно) ставится с целью выяснить природу внутримолекулярных сил. Методы исследования денатурации сильно отличаются, например, от методов изучения полимеризации или поликонденсации, так как в этих двух случаях известны точные характеристики начального и конечного состояний и обычно можно постулировать вероятную кинетическую схему. Если результаты эксперимента не совпадают с тем, что предсказано теоретически, то обычно бывает достаточно немного видоизменить схему, а не отказаться от нее вообще. При денатурации белков ни начальное, ни конечное состояния не определены, и заранее предложить возможный механизм, как правило, не удается. Поэтому исследования денатурации белков обычно ведутся широким фронтом, путем изучения влияния самых различных факторов на скорость реакции, и по настоящее время ни одно из исследований не привело к выяснению достоверного детального механизма процесса. [c.704]

В заключение необходимо обратить внимание на те трудности, которые возникают при изучении термодинамики и кинетики реакции денатурации из-за необратимости этого процесса для большинства белков. Известны лишь немногие случаи обратимой денатурации — например, для трипсина, химотрипсина, рибонуклеазы и ингибитора трипсина. Не следует думать, что немногочисленность известных случаев обратимой денатурации—это лишь следствие недостаточности наших знаний об условиях обращения процесса для большинства белков. Напротив, необратимость денатурации белков, построенных относительно более сложно и менее жестко , чем перечисленные выше, является закономерным следствием ничтожной вероятности полного восстановления чрезвычайно сложной системы связей, стабилизирующих конформацию полипептидных цепочек в нативной молекуле. Однако при рассмотрении обратимых реакций термодинамические и кинетические характеристики наиболее доступны и полнее выявляются. Возможно поэтому, что особый интерес представит в будущем выявление и исследование промежуточных состояний денатурируемого белка, сколь бы кратковременно ни было их существование. [c.193]

Исследования механизма свертывания, отвечающие второму подходу к установлению структурной организации белка, базируются на многочисленных физических, химических и биологических методах исследования, которые дают прямую или косвенную информацию о геометрических, термодинамических и кинетических аспектах процессов денатурации и ренатурации, механизме клеточного синтеза аминокислотной последовательности и взаимодействия белковых цепей с шаперона-ми. В исследованиях этого плана, как и предшествующего, надежда возлагается на то, что в результате анализа экспериментальных данных в конечном счете удастся разработать эмпирические правила, позволяющие предсказывать по известному химическому строению белка основные этапы свертывания, в первом случае, и нативную пространственную структуру, во втором. Далее, предполагается, если эти цели будут достигнуты, то станет ясно не только как возникает физиологически активная конформация, но и почему она возникает, т.е. бу- [c.77]

Термодинамические и кинетические экспериментальные исследования механизма ренатурации (денатурации) нативного белка и мутантов определение констант равновесия и скорости процессов расчет изменений свободной энергии стабильных структур, промежуточных и переходных состояний построение энергетических профилей путем свертывания белковых цепей дикого и мутантного типов. [c.392]

Термодинамическое и кинетическое исследование денатурации выявляет совершенно необычный характер этого процесса. В результате исследования равновесий (Куниц) и непосредственных измерений (Кистяковский) установлено, что денатурация является эндотермической реакцией с АН =85 ккал моль в случае ненсина, 67 ккал моль для трипсина и 57 ккал моль для белка, выделенного из сои (специфический ингибитор трипсина). Принимая, что, нанример, пепсин (мол. вес 35 ООО) содержит 300 аминокислотных остатков, вычисленная для одного аминокислотного остатка теплота реакции равна около 0,3 ккал. Таким образом, -кажется вероятным, что в реакции денатурации разрываются несколько слабых связей. (Для разрыва одной водородной связи необходимо 5 ккал следовательно, либо не разрываются все водородные связи молекулы, либо образуются новые подобные связи, причем измеряют только разность энергий.) [c.440]

В первых кинетических исследованиях денатурации белков в 1968 г. Ф. Поул [47] и К. Тэнфорд [23, 48] не обнаружили промежуточных продуктов кинетика процесса полностью отвечала переходу между двумя состояниями в соответствии с теорией Дж. Брандтса. Более сложное кинетическое поведение белков при денатурации удалось наблюдать в 1971 г. А. Икай и К. Тэнфорду при изучении скорости свертывания и развертывания полипептидных цепей лизоцима и цитохрома с с использованием техники стоп-флоу и УФ-спектроскопии [49]. Полученные зависимости интенсивности поглощения (у) от времени для двух белков приведены на рис. III.3. Кривые прямого и обратного процессов у лизоцима (рис. Ш.3,а) симметричны относительно Уравн, и соответствуют приведенному выше уравнению реакции первого порядка. Кривые же цитохрома с (рис. 111.3,6) не отвечают теории двух- [c.352]

Теперь можно сопоставить результаты термодинамического и кинетического исследования денатурации лизоцима и цитохрома с. П.Л. Привалов и H.H. Хечинашвили не выявили различия в механизме свертывания и развертывания этих белков [39]. Наблюдая хорошее совпадение вант-гоффовской энтальпии и тепловых эффектов, авторы сделали заключение об одинаковом механизме денатурации лизоцима и цитохрома с и соответствии механизма модели двух состояний. Кинетическое исследование денатурации этих же белков Икай и Тэнфордом с использованием гуанидингидрохлорида, независимо от отношения к трактовке авторов полученных данных, не дает оснований для такого вывода. Расхождение в термодинамической и кинетической оценках механизма денатурации цитохрома с тем более существенно, что, как было показано позднее Т. Тсонгом, этот белок даже в концентрированном растворе гуанидингидрохлорида не полностью денатурирован. [c.353]

Разработанный Ферштом эмпирический подход к изучению термодинамических и кинетических аспектов свертывания белковой цепи с привлечением сайт-направленного мутагенеза позволил автору и сотрудникам проанализировать все этапы формирования трехмерной структуры белка (барназы), не содержащего дисульфидных связей [31-33]. Изучение обратимой денатурации начинается с тщательного визуального анализа трехмерной структуры белка с целью выявления остатков, которые предположительно могут играть важную роль в структурной стабилизации и кинетике свертывания. Следующий этап заключается в модификации потенциально важных для сборки межостаточных взаимодействий путем специальных химических изменений белковых цепей актуальных остатков и сайт-направленного мутагенеза. Завершается этап составлением оптимального набора и его синтеза методами генной инженерии. Далее проводятся термодинамические и кинетические экспериментальные исследования механизма ренатурации (денатурации) нативного белка и мутантов, определения констант равновесия, констант скорости и величин изменений свободной энергии Гиббса стабильных структур, промежуточных и переходных состояний. Найденные значения используются для построения энергетических профилей путей свертывания белковых цепей дикого и мутантного типов. На их основе определяются разностные энергетические диаграммы, которые показывают различия в уровнях энергии всех состояний на пути свертывания белка и мутантов. Реализация описанной процедуры приводит к эмпирическим зависимостям между важными для свертывания белковой цепи взаимодействиями боковых цепей и параметрами, по мысли Фершта, характеризующими кинетику, равновесное состояние и механизм ренатурации [И]. Каждая мутация, которая в [c.87]

Исследования влияния углеводородов на конформационное состояние макромолекул глобулярных белков проводились методами оптического вращения и его дисперсии, вискозиметрически, спектрофотометрически и по изучению кинетических параметров ферментативной активности, Вращение плоскости поляризации чрезвычайно чувствительно к изменению конформации белковых молекул. Правда, между оптической активностью и структурой белка нет простой и ясной зависимости, но значение оптической активности как характеристики степени конформационного изменения белков общеизвестно и играет большую роль при изучении процессов денатурации. [c.29]

С. Левинталем [3]. Оно заключается в том, что структура нативного белка не обязательно должна обладать самой низкой энергией Гиббса, чтобы быть стабильной и свертываться спонтанно. В силу своей сложности молекула белка может находиться в метастабильном состоянии, т.е. отвечать не глобальному, а одному из локальных минимумов энергии. Еще задолго до этого, в 1935 г., Э. Бауэр — автор первого труда по теоретической биологии, видел в особом деформированном состоянии молекул специфику структурной организации белков, определяющую их биологические свойства [4]. Представление о метастабильном состоянии белковых молекул и о достаточной устойчивости этого состояния привело к формулировке так называемой кинетической гипотезы свертывания белка (Д. Уетлауфер и С. Ристоу [5]). В настоящее время не существует экспериментального метода, с помощью которого можно было бы различить стабильное и нестабильное состояние белковой молекулы. Конечно, при образовании такой сложной структуры априори нельзя исключить ситуацию, при которой глобальный минимум энергии окажется окруженным высоким потенциальным барьером и поэтому явится кинетически недостижимым. В данной главе и далее обсуждаются главным образом экспериментальные исследования процессов свертывания и развертывания белков, причем наибольшее внимание сосредоточено на молекулярных аспектах денатурации. [c.339]

При исследовании термодинамики и кинетики денатурации рибонуклеазы А Т. Тсонг и соавт, [53] столкнулись с парадоксальной ситуацией, впрочем, уже встречавшейся при изучении денатурации цитохрома с. С одной стороны, термодинамика свертывания белка в нейтральной среде показывает отклонение, а в кислой — близкое соответствие двухфазному процессу (М О). С другой стороны, кинетика развертывания рибонуклеазы А в этих условиях свидетельствует об обратном. Попытка объяснить наблюдаемое несоответствие термодинамических и кинетических данных привела Тсонга и соавторов к разработке так называемой постадийной модели свертывания и развертывания белка, претендующей на обобщение известных фактов о денатурации. [c.355]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология