Белки денатурации кинетика

Термолабильность ферментов. Скорость химических реакций зависит от температуры, поэтому катализируемые ферментами реакции также чувствительны к изменениям температуры. Установлено, что скорость большинства биохимических реакций повышается в 2 раза при повышении температуры на 10°С и, наоборот, снижается в 2 раза при понижении температуры на 10°С. Этот показатель получил название температурного коэффициента. Однако вследствие белковой природы фермента тепловая денатурация при повышении температуры будет снижать эффективную концентрацию фермента с соответствующим снижением скорости реакции. Так, при температуре, не превышающей 45—50°С, скорость реакции увеличивается согласно теории химической кинетики. При температуре выше 50° С на скорость реакции большое влияние начинает оказывать тепловая денатурация белка-фермента, приводящая к полному прекращению ферментативного процесса (рис. 4.16). [c.140]

Кинетика денатурации белков 703 [c.703]

Кинетика денатурации белков [c.705]

Кинетика денатурации белков 709 [c.709]

Кинетика денатурации белков 713 [c.713]

Кинетика денатурации белков 715 [c.715]

А. Ф. Усатый. Разрыв водородных связей в нативном белке обычно связывают с его денатурацией. Некоторые наши измерения показывают, что величины выходов радикалов и предельные концентрации в денатурированном и нативном белке отличаются не очень сильно (в 2—3 раза), но кинетика исчезновения радикалов после облучения различна, что может быть связано с разными константами диффузии газов. [c.214]

Кинетика денатурации белков также весьма своеобразна. Как правило, денатурация может быть охарактеризована как реакция первого порядка. Однако в отличие от большинства известных реакций первого порядка денатурация характеризуется очень высоким температурным коэффициентом. Обычно возрастание скорости реакции при повышении температуры на 10° является 2—3-кратным. При денатурации наблюдается ускорение в 100 и более раз. Это соответствует очень высоким энергиям активации реакции денатурации — порядка 40 000 — [c.192]

В заключение необходимо обратить внимание на те трудности, которые возникают при изучении термодинамики и кинетики реакции денатурации из-за необратимости этого процесса для большинства белков. Известны лишь немногие случаи обратимой денатурации — например, для трипсина, химотрипсина, рибонуклеазы и ингибитора трипсина. Не следует думать, что немногочисленность известных случаев обратимой денатурации—это лишь следствие недостаточности наших знаний об условиях обращения процесса для большинства белков. Напротив, необратимость денатурации белков, построенных относительно более сложно и менее жестко , чем перечисленные выше, является закономерным следствием ничтожной вероятности полного восстановления чрезвычайно сложной системы связей, стабилизирующих конформацию полипептидных цепочек в нативной молекуле. Однако при рассмотрении обратимых реакций термодинамические и кинетические характеристики наиболее доступны и полнее выявляются. Возможно поэтому, что особый интерес представит в будущем выявление и исследование промежуточных состояний денатурируемого белка, сколь бы кратковременно ни было их существование. [c.193]

Изучение обратимой денатурации начинается с тщательного визуального анализа трехмерной структуры белка с целью выявления остатков, которые предположительно могут играть важную роль в структурной стабилизации и кинетике свертывания белковой цепи. [c.392]

Существуют и некристаллические упорядоченные структуры. По причинам, которые изложены ниже, довольно бессмысленно их систематизировать, за исключением, разве что, глобул, которые вполне дискретны, но не обязательно обладают внутренним дальним порядком. Дело в том, что путаница, царящая в монографической и журнальной литературе по поводу надмолекулярных структур, особенно в некристаллизующихся полимерах, обусловлена пренебрежением принципами статистической физики и физической кинетики. Описание полимеров на всех уровнях структурной организации не может быть полным, если наряду с морфологией не учитывается подвижность соответствующих структурных элементов . А введение подвижности ав томатически требует, при описании надмолекулярной организации в целом, не только описания пространственного распределения и -сил взаимосвязи структурных элементов, но и усреднения во времени (ср. стр. 45). При этом сразу выявляется третий признак классификации структур по их стабильности. Как известно, по отношению к так называемой денатурации все глобулярные белки принято подразделять на кинетически и термодинамически стабильные. ЭтОт же принцип должен реализоваться и по отношению к надмолекулярным уровням структурной организации полимеров. Все дискретные организованные структуры являются термодинамически стабильными отдельные организованные морфозы (типа сферолитов, например) могут обладать определенной — и регистрируемой, (см. гл. VII) — внутренней и внешней подвижностью, но ниже температуры фазового перехода они вполне устойчивы в отсутствие внешних силовых полей их время жизни т->оо. [c.47]

В общем случае для ферментативной реакции существует оптимальное значение pH при увеличении или уменьшении pH по сравнению с его оптимальным значением максимальная скорость Уд падает. В нейтральной области pH влияние его изменений на реагирующую систему носит обычно обратимый характер, но при предельных значениях pH (соответствующих сильнокислой или сильнощелочной среде) белки подвергаются необратимой денатурации. Влияние обратимых изменений pH на кинетику можно объяснить изменениями степени ионизации субстрата если же в исследуемом интервале pH степень ионизации субстрата не меняется, то изменения в кинетике объясняются ионизацией фермент-субстратного комплекса. Если фермент-суб-стратный комплекс существует в трех состояниях с разным числом протонов и если только промежуточная форма разлагается с образо ванием продуктов, то уравнение, описывающее влияние pH на максимальную скорость реакции, можно вывести из схемы [c.322]

Имеется еще одно возражение против гипотезы о расплавленной глобуле, использующейся вместе с аппаратом равновесной термодинамики и формальной кинетики для объяснения экспериментальных фактов. Конкретной теоретической основой интерпретации данных о денатурации служит термодинамическая теория двух состояний Брандтса [12, 13]. Как уже отмечалось, белковая молекула в растворе, согласно этой теории, может быть представлена большим количеством микросостояний. Все они входят в состав либо распределения N (нативное макросостояние белка), либо О (денатурированное макросостояние). Теория Брандтса сделала возможным относительно простой термодинамический анализ конформа-ционного перехода N — О в предположении, что реализующиеся микросостояния не являются чем-то вновь созданным, а присутствуют в распределении N и О. Это означает, что в теории постулируется отнюдь не очевидное положение об отсутствии новых промежуточных конформационных состояний в области перехода N - О. Следовательно, главный критерий справедливости теории двух состояний Брандтса состоит в требовании отсутствия максимумов, минимумов и потенциальных ям в наблюдаемых изменениях энтальпии и энтропии при переходе от О к N (и наоборот). Иными словами, если образование трехмерной структуры белка происходит, как того требует теория двух состояний, путем постоянного усложнения и приближения к нативному состоянию, то изменения энтальпии, энтропии и свободной энергии по ходу ренатурации должны быть монотонными. Отсутствие экстремумов означает отсутствие между нативной структурой и статистическим клубком метастабильных промежуточных состояний. Механизм сборки белка проходит в этом случае в одну стадию. А теперь обратимся вновь к обсуждаемой гипотезе о расплавленной глобуле в которой постулируется образование на пути к нативной структуре близкое к ней промежуточное состояние. При существовании достаточно устойчивых обнаруживаемых экспериментально интермедиатов зависимости изменений энтальпии, энтропии и свободной [c.85]

Разработанный Ферштом эмпирический подход к изучению термодинамических и кинетических аспектов свертывания белковой цепи с привлечением сайт-направленного мутагенеза позволил автору и сотрудникам проанализировать все этапы формирования трехмерной структуры белка (барназы), не содержащего дисульфидных связей [31-33]. Изучение обратимой денатурации начинается с тщательного визуального анализа трехмерной структуры белка с целью выявления остатков, которые предположительно могут играть важную роль в структурной стабилизации и кинетике свертывания. Следующий этап заключается в модификации потенциально важных для сборки межостаточных взаимодействий путем специальных химических изменений белковых цепей актуальных остатков и сайт-направленного мутагенеза. Завершается этап составлением оптимального набора и его синтеза методами генной инженерии. Далее проводятся термодинамические и кинетические экспериментальные исследования механизма ренатурации (денатурации) нативного белка и мутантов, определения констант равновесия, констант скорости и величин изменений свободной энергии Гиббса стабильных структур, промежуточных и переходных состояний. Найденные значения используются для построения энергетических профилей путей свертывания белковых цепей дикого и мутантного типов. На их основе определяются разностные энергетические диаграммы, которые показывают различия в уровнях энергии всех состояний на пути свертывания белка и мутантов. Реализация описанной процедуры приводит к эмпирическим зависимостям между важными для свертывания белковой цепи взаимодействиями боковых цепей и параметрами, по мысли Фершта, характеризующими кинетику, равновесное состояние и механизм ренатурации [И]. Каждая мутация, которая в [c.87]

Таким образом, обсуждаемая выше инактивация гидрогеназы в присутствии кислорода протекает с участием по крайней мере двух состояний фермента. В механизме катализа гидрогеназами кинетический процесс, характеризуемый временем тг, в отсутствие кислорода практически не имеет места. В этих условиях кинетика процесса, характеризуемая параметром ть отражает, по-видимому, тепловую денатурацию белка. В присутствии кислорода появляется второй экспоненциальный член в кинетике инактивации. В этих условиях происходят, по-видимому, процессы окисления функционально важных групп активного центра фермента, что влечет за собой его необратимую инактивацию. [c.103]

ОТ времени, но иногда требуется более точная оценка. Наиболее вероятный порядок реакции может быть определен с помощью статистики, как сделали Лауфер и Прайс при изучении кинетики термической денатурации белка вируса табачной мозаики. Их метод состоит в следующем наилучщая прямая линия рассчитывалась методом наименьших квадратов для случаев зависимости [c.57]

Начальные значения pH брались различными, так что в исходном белке часть энзиматической активности была уже потеряна. При этом обнаружилось, что понижение теплоты денатурации не соответствовало понижению оставшейся энзиматической активности. Таким образом, казалось, что калориметрические измерения относятся к иной (вызываемой щелочью) реакции и не являются измерениями энзиматической активности. В последнее время Бендер и Стуртевант [191] снова исследовали эту реакцию, применяя метод экстраполяции, описанный на стр. 173. Если реакция проводилась в буферном растворе при постоянном pH, наблюдалось небольшое поглощение тепла, и кинетика поглощения тепла была точно такой же, как и кинетика потери пищеварительной ( pepti ) активности. Этот результат указывает на то, что при pH, равном приблизительно 6, при котором работали Бендер и Стуртевант, поглощение тепла вызывается именно процессом денатурации, если принять, что этот последний включает все очень быстрые процессы, как, например, ионизацию, сопровождающие первичную реакцию. Теплота реакции весьма сильно зависит от pH, приблизительно удваиваясь в области pH между 6,2 и 6,4. Повидимому, процесс денатурации протекает различно при разных значениях pH. [c.169]

Фотоденатурация нуклеиновых кислот является следствием разрушения кооперативной системы слабых нековалентных связей (водородные, гидрофобные и т. д.) и частичного (локального) или полного нарушения двуспиральной структуры Уотсона — Крика (эффект расплетания ). Наиболее вероятно, что денатурация нуклеиновых кислот представляет собой вторичный темновой процесс, вызванный образованием фотопродуктов, хотя не исключена возможность прямого разрыва слабых связей при тепловой диссипации энергии электронного возбуждения оснований, как это предполагается для белков. Несмотря на то, что спектр действия денатурации ДНК совпадает со спектром поглощения тимидина, причастность тиминовых димеров к образованию денатурированных участков в ДНК остается до сих пор сомнительной. Г. Б. Завильгельским твердо установлено, что локальные нарушения вторичной структуры ДНК при ее облучении коротковолновым светом определяются индукцией сшивок между комплементарными нитями ДНК. Наиболее точно такой вывод подтверждается опытами, в которых миграционным путем с ацетофенона на тимин изменялось количество тиминовых димеров в ДНК. При этом каких-либо различий в кривых плавления, отражающих состояние вторичной структуры, у образцов ДНК, содержащих 0,17 и 30% димеров, обнаружить не удалось. В то же время кинетика образования сшивок и локальных денатурационных участков в ДНК идентична. [c.241]

Кинетические аспекты. Трудно представить, что белки могут принимать нативную физиологически активную конформацию, сворачиваясь случайным образом по принципу "проб и ошибок". Даже в условиях in vitro самопроизвольная сборка трехмерной структуры белка, не содержащего дисульфидных мостиков, происходит настолько быстро, что дает основание допустить во много раз большую скорость этого же процесса в условиях in vivo по сравнению со скоростью рибосомального матричного синтеза аминокислотной последовательности. Создание за считанные секунды из развернутой полипептидной цепи трехмерной структуры макромолекулы возможно только при высокой степени кооперативности процесса. Естественно было ожидать, что кинетика этого процесса будет соответствовать такому механизму ренатурации белка, при котором происходящие на каждом участке последовательности события увеличивают вероятность и, следовательно, скорость последующей укладки всех отдельных участков цепи в направлении правильной нативной конформации. Данному условию удовлетворяет самый простой механизм самоорганизации белков, включающий единственный переход между двумя состояниями (N D). Согласно теории этого процесса, которая только что была рассмотрена, никакие другие состояния белковой цепи, кроме N и D, не присутствуют в экспериментально обнаруживаемых количествах в течение всего времени прямой (N -> D) и обратной (N D) реакций. Если развертывание и свертывание белковой цепи действительно следуют двухстадийному процессу, то изучение кинетики и выяснение деталей конкретного механизма денатурации и ренатурации сталкивается с особенно серьезными трудностями. Они вызваны большими скоростями реакции и малыми концентрациями промежуточных состояний, а это требует быстрореагирующей и высокочувствительной экспериментальной техники. Наиболее часто используются спектральные методы (ЯМР, КД, УФ), ферментативный гидролиз, иммунологические методы. Для быстрой остановки процесса применяются методы стоп-флоу. [c.352]

В первых кинетических исследованиях денатурации белков в 1968 г. Ф. Поул [47] и К. Тэнфорд [23, 48] не обнаружили промежуточных продуктов кинетика процесса полностью отвечала переходу между двумя состояниями в соответствии с теорией Дж. Брандтса. Более сложное кинетическое поведение белков при денатурации удалось наблюдать в 1971 г. А. Икай и К. Тэнфорду при изучении скорости свертывания и развертывания полипептидных цепей лизоцима и цитохрома с с использованием техники стоп-флоу и УФ-спектроскопии [49]. Полученные зависимости интенсивности поглощения (у) от времени для двух белков приведены на рис. III.3. Кривые прямого и обратного процессов у лизоцима (рис. Ш.3,а) симметричны относительно Уравн, и соответствуют приведенному выше уравнению реакции первого порядка. Кривые же цитохрома с (рис. 111.3,6) не отвечают теории двух- [c.352]

Тщательное параллельное изучение кинетических аспектов конформационных изменений и ферментативной активности при денатурации шести белков (фумаразы, энолазы, альдолазы, глицеральфос-фатдегидрогеназы, лактатдегидрогеназы и малатдегидрогеназы) было предпринято в 1971 г. Дж. Тейпелем и Д. Кошландом [51]. Для каждого объекта исследовано влияние на кинетику свертывания фермента и восстановление его биологической функции наличия в растворе соответствующего субстрата или кофактора (S), изменения ионной силы молекулы и концентрации. Заключения о конформационных изменениях делались по данным кривых дисперсии оптического вращения ферментов, показывающих характерный для них отрицательный эффект Коттона при 232—234 нм, и спектров флуоресценции в области 300— 400 нм. [c.354]

При исследовании термодинамики и кинетики денатурации рибонуклеазы А Т. Тсонг и соавт, [53] столкнулись с парадоксальной ситуацией, впрочем, уже встречавшейся при изучении денатурации цитохрома с. С одной стороны, термодинамика свертывания белка в нейтральной среде показывает отклонение, а в кислой — близкое соответствие двухфазному процессу (М О). С другой стороны, кинетика развертывания рибонуклеазы А в этих условиях свидетельствует об обратном. Попытка объяснить наблюдаемое несоответствие термодинамических и кинетических данных привела Тсонга и соавторов к разработке так называемой постадийной модели свертывания и развертывания белка, претендующей на обобщение известных фактов о денатурации. [c.355]

После обнаружения целой гаммы промежуточных состояний на пути от полностью денатурированного белка к нативному Крейтон детально изучил кинетику изменений и взаимопревращений этих состояний в ходе свертывания и развертывания белковой цепи. Далее он выяснил оптимальные условия моментальной остановки процесса ренатурации БПТИ и гашения тиол-дисульфидной реакции обмена, а затем разработал способы фиксации и выделения промежуточных состояний, определения у них количества дисульфидных связей и мест их локализации в аминокислотной последовательности БПТИ. Таким образом, последующее изучение денатурации белка, а именно получение количественных данных о кинетике и термодинамике всех этапов процесса и доказательное описание механизма самоорганизации пространственной структуры белка in vitro, имеет серьезную основу, созданную Крейтоном в результате огромной целенаправленной подготовительной работы. [c.367]

Привлечение к проблеме свертывания белка сайт-направленного мутагенеза и использование уравнений равновесной термодинамики и формальной кинетики позволили Фершту и соавт. предпринять попытку решить две задачи. Первая из них основывалась на опытных значениях констант равновесия и заключалась в определении вызванных мутациями изменений в стабильности основных состояний белковой цепи. Ее цель состояла в установлении эмпирических соотношений между глобальной свободной энергией и энергией невалентных взаимодействий боковых цепей в различных областях белковой глобулы [133]. Вторая задача исходила из результатов кинетических измерений процессов свертывания и развертывания нативного белка и мутантов и имела цель обнаружить изменения энергии промежуточных состояний и энергии активации (рис. П1.16). Различия в энергетических уровнях промежуточных (AAGj) и переходных (ДДО ) состояний помогали определить их положения на пути структурной самоорганизации белковой цепи. При этом каждая аминокислотная замена служила своеобразной репортерской меткой наблюдаемого изменения, происходящего на мутированном участке по ходу ренатурации или денатурации. [c.390]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология