Линкеры, получение

Для получения линкеров синтезируют олигомеры, которые представляют собой палиндромные одноцепочечные нуклеотидные последовательности, спаривающиеся (гибридизующиеся) между собой. Линкеры содержат сайты узнавания для рестрицирующих эндонуклеаз, что позволяет осуществлять с их помощью клонирование фрагментов ДНК (рис. 5.8, А и Б). Короткий дуплекс длиной 6-12 пар нуклеотидов лигируют по тупым концам с ДНК-мишенью (обычно кДНК). Разрезают новую молекулу нужной рестрицирующей эндонуклеазой и получают фрагменты с выступающими одноцепочечными концами (липкими концами), с помощью которых встраивают ДНК-мишень в соответствующий вектор. Прежде чем проводить встраивание, рестрицированную смесь фракционируют для отделения ДНК с липкими концами от лишних линкерных молекул. Вектор тоже обрабатывают рестриктазой, отжигают его с фрагментами ДНК с липкими концами и сшивают с помощью ДНК-лигазы фага Т4. ДНК-мишень не должна содержать сайтов рестрикции, присутствующих в линкерной последовательности, в противном случае она также будет расщепляться ферментом. [c.85]

Синтетические олигонуклеотиды используются в качестве линкеров или адаптеров для облегчения встраивания ДНК в векторы, затравок для ферментативного синтеза ДНК, а также затравок при секвенировании ДНК и РНК. Их применяют для сайт-направленного мутагенеза и как контрольные элементы для изучения экспрессии генов. Синтетические нуклеотиды используют также для конструирования полных генов. В зависимости от цели использования их длина варьирует от 5 до 60 нуклеотидов. Трудности, возникающие при получении длинных олигонуклеотидов, связаны не с собственно их синтезом, а с очисткой материала. [c.88]

Продукт полного измельчения линкера, полученного спеканием окиси цинка, окиси магния, кремнезема и окиси висмута при 970-980 С [c.282]

При экстрагировании бензолом под давлением (по Фишеру) при температуре 270° С извлекается битум, названный битумом В. Этот битум по растворимости в петролейном эфире разделяется на маслянистый и твердый. Хотя такое деление мало обосновано химически, однако с его помощью оказалось возможным предложить объяснение процессу получения -металлургического кокса. Твердым битумом называется твердый нерастворимый осадок, который выделяется из спирто-бензольной вытяжки при разбавлении ее петролейным эфиром. Часть же битумов остается в таком разбавленном бензольном растворе и после испарения растворителя имеет вид маслообразной, более пли менее вязкой жидкости, за что получила название маслянистого битума. Количество маслянистых битумов по мере старения угля и накопления в нем углерода растет по сравнению с количеством твердого битума. Так, по данным Агде и Линкера, в жирном угле отношение маслянистого битума к твердому было 47 62, а у антрацита 10 2. [c.50]

ЛИНКЕР. Синтетический, короткий двухцепочечный олигонуклеотид, содержащий сайты узнавания для ряда рестрикционных эндонуклеаз может быть присоединен к концам фрагмента ДНК, полученного с помощью какой-либо другой рестриктирующей эндонуклеазы, в процессе реконструирования рекомбинантной ДНК. [c.523]

Основной подход при получении линкеров такой же, как и при получении вектора-затравки. [c.61]

К тупым концам фрагментов ДНК можно присоединять короткие двухцепочечные олигонуклеотиды, называемые линкерами, которые содержат требуемый сайт рестрикции. По завершении лигирования по тупым концам линкера и фрагмента ДНК для получения липких концов образовавшиеся гибридные фрагменты инкубируют с рестриктазой, специфичной в отношении сайта рестрикции линкера. [c.59]

Далее полученную кДНК можно встроить в соответствующ>1Й вектор с помощью линкеров или коннекторной техники. [c.436]

После отделения гидроокиси магния раствор, содержащий хлористый кальций, может быть использован для обработки прокар-брнизованного доломитового молока и превращен в Mg b. Изучен процесс получения окиси магния из доломита и содержащих СаСЬ отработанных щелоков содового производства Недостатком известкового способа получения магнезий является загрязнение продукта значительным количеством окиси кальция-. Для получения Mg(OH)2 с малым содержанием СаО следует применять свежеприготовленное разбавленное известковое молоко при низкой температуре, а также удалять СО2 из воды и рапы. При взаимодействии разбавленной рапы и доломитового молока с концентрацией 10 /о твердой фазы получается гидроокись магния с содержанием 4—5% СаО. Такое содержание СаО в 2—3 раза меньше, чем в гидроокиси, полученной с помощью известкового молока. Магнезиальный г линкер, пригодный для основных магнезиальных огнеупоров, содержащий меньше 1—2% СаО, можно получить, если предварительно удалять из рапы ионы SOl - обрабатывая ее доломитовым молоком . [c.293]

В пенетрометричеоком методе используется игла, которая погружается на различную глубину в размягчаемый при нагревании уголь. В Советском Союзе некоторое время применяли прибор для пенетрометрического испытания, предложенный И. Агде и Л. Линкером. Не описывая прибора, который уже не находит применения, отметим только, что Сам метод исследования заключался в определении глубины и скорости погружения иглы в размягчающийся уголь, находящийся в стальной трубке. Несколько кривых, полученных при нагрузке на иглу 100 г и скорости нагрева 5 °С в минуту, приведены на рис. 58. Кривая 1 характеризует уголь с маловязкой пластической массой, свобод- [c.348]

Степень суперспирализации этого компактного тела можно измерить по его реакции на бромистый этидий (гл. 28), Полученные данные свидетельствуют о суше-ствовании примерно одного отрицательного супервитка на 200 п. н. Эти супервитки можно удалить, вводя одноцепочечные разрезы с помощью ДНКазы нуклеосомы при этом остаются. Следовательно, суперспирализация, очевидно, обусловлена расположением нуклеосом и должна заключаться в скручивании линкеров между отдельными нуклеосомами. Для полной релаксации супервитков нужен один одноцепочечный разрез на каждые 85 т. п. н. Таким образом, средняя длина замкнутой ДНК равна [c.374]

Рис. 16.3. Мутантные гены i/с, полученные, как показано на рис. 16.2. Нормальная последовательность соответствующей области гена tk приведена в верхней строке (показана только последовательность некодирующей цепи). Встраивание в эту последовательность Ват HI-линкера на различных участках приводит к возникновению нуклеотидных замен, выделенных цветом. Эффективность транскрипции для каждого из мутантных генов указана в табл. 16.2 (По M KnightS.L, Kingsbury R., 1982. S ien e 217, 316.)

Препараты ДНК после сшивки мини хромо(ом псорапеном и денатурации Нуклео сомы, в которых сшивка ДНК не происходит, вы лядят как пузырьки Видно (стрелки) что цепи РНК мо1ут отходить как от нуклеосом (а б), так и от линкеров (б) Треугольники показывают свободную от нуклеосом зону (по результатам, полученным Т Коллером и соавт ) [c.155]

Часто у экспериментатора возникает потребность клонирования фрагмента ДНК, полученного расщеплением одной рестриктазой, в векторе, имеющем сайт расщепления для другой рестриктазы. С этой целью щироко применяются короткие синтетические двуспиральные олигонуклеотиды, имеющие в своем составе сайты узнавания для одной или нескольких рестриктаз. Такие олигонуклеотиды называют линкерами или поли/шнкерами (см. рис. 27) соответственно. " [c.142]

Для получения Fv-фрагментов антител с помощью бактериофага вначале кДНК для Vh- и VL-областей, синтезированную с использованием В-клеточной мРНК, амплифицируют методом полимеразной цепной реакции. Затем эти гены соединяют линкером, получая ген для Fv-фрагмента. Такой ген трансфицируют в бактерии (Е. со//), используя фазмидный вектор, содержащий лидерную последовательность и фрагмент гена, кодирующего белок оболочки фага М13. Далее, бактерии инфицируют фагом М13. Фаг реплицируется и экспрессирует на одном из своих полюсов Fv. Фаги нужной специфичности изолируют при помощи пэн-нинга на покрытых антигеном подложках и амплифицируют. Антигенспецифичные фаги можно использовать для инфицирования штаммов бактерий, обеспечивающих выделение Fv-белка в культуральную среду. [c.538]

Выделение клонируемых фрагментов из рекДНК, полученных э ими способами, естественно, затруднено. В случае необходимости переклонирования используют векторы, имеющие в себе полилинкеры, или применяют линкеры и адаптеры. [c.246]

Прежде всего была создана плазмида, имеющая в своем составе слитые части генов lad и la Z при транскрипции и трансляции такого химерного гена образуется белок с ферментативной активностью /З-галактозидазы. Слитый ген la l - Z в плазмиде pLG (рис. 3.8) не имеет промотора и поэтому не экспрессируется. Встройкой линкеров в начало структурной части этого гена можно вводить различные места узнавания рестриктаз. Для каждого конкретного случая выбирается определенная последовательность нуклеотидов вводимого линкера. Если по выбранному месту расщепления рестриктазой встроить последовательность любого гена X, кодирующую N-шнцевую часть полипептида, то образованный гибридный ген будет детерминировать синтез химерного белка, по-прежнему обладающего ферментативной активностью )3-галактозидазы. ДНК полученной [c.151]

В 1980 г. эта же группа исследователей получила продукцию человеческого интерферона в клетках Е. соИ. С помощью химически синтезированного линкера в векторную плазмиду под контроль сильного irp-npoMOTOpa бьша точно встроена кДНК лейкоцитарного интерферона al человека. При этом в клетках Е. соИ, содержащих сконструированную плазмиду, выявлялся эффективный синтез индивидуального белка интерферона человека (от 3,6 107до2,5 10 единиц активности интерферона на 1 л культуры). Полученный белок, как и природный интерферон человека, обладал антивирусным действием, и введение его в организм мартышек предотвращало гибель этих животных после инфицирования вирусом энцефаломиокардита. [c.162]

Интересен вариант мутагенеза молекул ДНК за счет встройки в случайные места экзогенных сегментов ДНК — природных фрагментов или синтетических линкеров (см. рис. 6.1, в). Случайные двухцепочечные разрывы можно вводить в молекулы ДНК путем кратковременного воздействия на них небольшого количества панкреатической ДНКазы I в присутствии катионов Мп2+. Получить молекулы ДНК с одиночными разрывами в разных местах можно, обрабатывая их рестриктазой, имеющей много участков узнавания на данном субстрате, так чтобы каждая молекула ДНК гидролизовалась в среднем лишь по одному участку. Таким образом, в частности, был получен первый гибридный фаг М13тр1 (см. 2.2.6). [c.173]

Введение сайтов рестрикции. Короткие фрагменты ДНК с тупыми концами, содержащие последовательности с сайтами для шецифичесжих рестриктирующих эндонуклеаз, получают путем химического синтеза. Структуры двух таких линтеров и способ получения с их помощью липких концов у вставки с тупыми концами показаны на рис. 6.19. Соединение линтера со вставкой катализируется Т4-лигазой. Затем эту ДНК обрабатывают соответствующей рестриктирующей эндонуклеазой, чтобы получить липкие концы. На этом последнем этапе возникают проблемы. Если фрагмент, к которому присоединены линкеры, содержит сайт узнавания для используемого фермента, то образование липких концов приводит к нарущению целостности фрагмента. Эту проблему можно рещить двумя способами. Первый состоит в использовании другого линтера. Второй основан на защите внутренних сайтов путем метилирования с помощью метилазы. [c.290]

В лаборатории можно создать новые сочетания неродственных генов и клонировать их в клетках-хозяевах. Прежде всего синтезируется рекомбинантная молекула ДНК путем соединения какого-либо фрагмента ДНК с ДНК вектора, который может автономно реплицироваться в подходящем хозяине. Наиболее подходящие векторы - фаг лямбда, вирус 8У-40 и плазмиды. Ферменты рестрикции и ДНК-лигаза - основные инструменты для получения новых молекул ДНК. Липкие концы, гомоиолимерные концевые фрагменты и химически синтезированные линкеры-три способа соединения [c.215]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология