Фермент конформационный переход при связывании субстрата

Рис. 9-19. Схематическая модель взаимодействия между субъединицами аллостерического фермента. У многих аллостерических ферментов центр связывания субстрата и центр связывания модулятора расположены в разных субъединицах-соответственно каталитической (С) и регуляторной (К). Сообщение о присоединении положительного модулятора М к его специфическому центру в регуляторной субъединице передастся посредством конформационных изменений каталитической субъединице, которая становится активной и ее сродство к связывающемуся с ней субстрату 8 новыщается. После отделения модулятора М от регуляторной субъединицы фермент вновь переходит в неактивную или менее активную форму.

Следует тем не менее подчеркнуть, что структура кристаллической решетки играет определенную роль, нанример, в эффекте связывания лизоцимом ионов металлов. Так, после вымачивания тетрагонального лизоцима в растворе Gd (III) в течение 20 часов степень заполнения активного центра ионами металлов составляла 24—38%, а в случае триклинного лизоцима эта величина составила 1,6—3,6% после вымачивания в течение 4 недель [33]. Это говорит о различной межмолекулярной упаковке белков в двух данных полиморфных формах кристаллического лизоцима. Тем не менее результаты исследования методами ЯМР [46] и рентгеноструктурными методами [2] в целом показали, что кон- формация лизоцима и ориентация функциональных групп его активного центра весьма близки (если не идентичны) в растворе и кристалле [46]. В цитируемой работе [46], однако, ие обсуждается, что рентгеноструктурный анализ был выполнен при низких или комнатных температурах, а изучение ЯМР — ири 54° С [46]. Иначе говоря, эти исследования выполняли по разные стороны от температуры конформационного перехода фермента (25—30° С 47—54]) и, следовательно, с различными конформациями лизоцима, которые заметно различаются по эффективности связывания фрагментов субстрата и, возможно, по конформации активного центра. Вопрос этот остается пока открытым в литературе, но требует более критического анализа при сопоставлении экспериментальных данных, полученных при различных условиях (в особенности, данных по изучению структуры фермента в растворе и кристаллическом состоянии). [c.158]

Были разработаны методы для изучения очень быстрых переходных процессов, хотя трудности, связанные с решением уравнений скорости, иногда мешают анализу таких систем. Однако, даже если нельзя решить уравнения скорости, в случае многих кинетических систем решение можно найти для условий, близких к равновесным. Это делают линеаризацией уравнений скорости, что приводит к системе линейных дифференциальных уравнений, которую можно решить стандартными методами. Для исследования быстрых процессов вблизи равновесия можно использовать релаксационную спектрометрию, регистрируя кинетику перехода химических форм системы к новому положению равновесия. Такой подход привел к пониманию деталей многих процессов. При изучении спектров времен релаксации ферментативных реакций было обнаружено, что связывание субстрата (лиганда) с ферментом происходит с частотой на 1—2 порядка ниже предельной величины, соответствующей случаю диффузионного контроля. Кроме того, обнаружены конформационные изменения молекулы белка, время протекания которых составляет от 10- до Ют с. [c.82]

Пример 15-Ж. Обнаружение конформационного перехода в ферменте при связывании субстрата. При добавлении к а-химо-трипсину ТНС флуоресцирует и, следовательно, должен с ним связываться. ТИС не является конкурентным ингибитором ферментативного гидролиза различных субстратов, так что он не может присоединяться к участку связывания субстрата. Однако добавление субстрата вызывает уменьшение флуоресценции. Это уменьшение могло быть результатом уменьшения связывания (ТНС флуоресцирует только в том случае, если он связан) или умень- [c.429]

Какова природа изменений активности фермента, вызываемых связыванием аллостерического эффектора или ковалентной модификацией (например, фосфорилированием) Почему графики зависимости активности фермента от концентрации субстрата или эффектора часто имеют сигмоидный характер Для ответа на эти вопросы необходимо сначала определить трехмерную структуру фермента при высокой степени разрешения, а затем установить, какие именно изменения конформации фермента происходят при связывании субстратов и эффекторов или при ковалентной моди--фикации. Только для двух ферментов, рассмотренных в гл. 2, 4 и 5 —АТКазы [1] и фосфорилазы [2—4],— получены рентгеноструктурные данные с разрешением 0,3 нм. И даже для этих ферментов представления о природе конформационных изменений при действии -аллостерических эффекторов имеют предварительный характер. Имеются данные о том, что при переходе АТСазы из активного в неактивное состояние происхо-.дит небольшое увеличение объема молекулы фермента сохранение структуры R — R (рис. 2.12) позволяет предполагать, что при этом изменяется положение тримеров, образованных каталитическими субъединицами, относительно димеров регуляторных субъединиц. [c.135]

Этим функции белка как фермента или апофермента скорее всего не исчерпываются. Все рассмотренные ме-чанизмы предполагали достаточно статичное расположение функциональных групп белка в активном центре Это не совсем верно. Взаимодействие с субстратом нередко сопровождается изменением конформации белковой молекулы, и согласно теории, выдвинутой Кошландом, направленные конформационные изменения белка являются важным фак1чэром ферментативного превращения. В отдельных случаях такие изменения зарегистрированы с помощью рентгеноструктурного анализа. Например, карбоксипептидаза А была подвергнута рентгеноструктурному анализу как в отсутствие субстрата, так и в комплексе с глицил-1/-тирозином. Полость, в которой находится активный центр, существенно сужается при связывании этого субстрата, т.е, наблюдается отчет ливый конформационный переход. Кроме того, широко дискутируется и имеет в отдельных случаях убедительные подтверждения гипотеза, согласно которой фермент фиксирует субстрат в конс юрмации, существенно более близкой по своей геометрии к активированному комплексу реакции, чем конформация субстрата, преобладающая у несвязанных молекул. Это, естественно, должно приводить к снижению активационьюго барьера реакции и способствовать существенному ускорению превращения. [c.208]

В некоторых случаях ионы металла можно ввести в систему, которая первоначально не содержит таких катионов. Таким примером может служить гликогенфосфорилаза Ь, катализирующая превращение полисахарида гликогена в фосфорилированные моно-сахаридные единицы глюкозо-1-фосфата (Г-1-Ф). Путем измерения скорости протонной релаксации в присутствии Мп + и фермента было показано [П], что этот катион специфически связывается по определенным центрам фермента. Важная особенность этого фермента состоит в том, что он неактивен в отсутствие другого лиганда — аденозинмоно( сфата (АМФ), который усиливает связывание субстратов и повышает максимальную скорость действия фермента. Инозинмонофосфат (ИМФ) активирует фермент только путем повышения максимальной скорости, но не сродства к субстратам, и это различие в механизмах активации отражается на результатах измерения ускорения протонной релаксации в присутствии парамагнитных ионов. Введение АМФ в систему, содержащую Мп + и фосфорилазу, изменяет скорость релаксации протонов воды, тогда как добавление ИМФ не дает заметного эффекта. Отсюда делают вывод о конформационном переходе в белке, индуцированном связыванием АМФ, который сопровождается изменением т,-для взаимодействия Мп +—НгО. Аналогичные измерения в присутствии Г-1-Ф позволили предположить наличие ряда конформационных состояний фермента, исходя из данных по скорости релаксации протонов воды [И]. [c.387]

Т. В. Есаковой и М. В. Ивановым (1992) показано, что связывание ЛДГ с мембранами саркоплазматического ретикулума ведет к снижению удельной активности фермента на 60—70 %, Высказано предположение о том, что взаимодействие фермента с мембранами происходит в участках с высоким и низким сродством. Добавление МАВН, НАВ , а также повышение ионной силы раствора вызывает солюбилизацию связанного фермента. Снижение активности ЛДГ в связанном состоянии можно объяснить как маскировкой некоторых субъединиц, диффузионными затруднениями при связывании субстратов, конформационными перестройками молекулы ЛДГ, так и изменениями физико-химических свойств среды при переходе фермента из раствора в при-мембранный слой. [c.176]

В последовательной модели предполагается, что фермент приобретает каталитически активную конформацию только в результате взаимодействия с субстратом (рис. 16.10). Если фермент состоит из нескольких субъединиц, то конформационное изменение одной из них, вызванное субстратом, последовательно передается другим субъединицам и облегчает им связывание добавочных молекул субстрата. Возможно образование несимметричных олигомеров (на рис. 16.10 это тетрамеры) с субъединицами, имеющими разную конформацию. Присутствие активаторов способствует переходу в активную форму, а отрицательные эффекторы его затрудняют. [c.489]

Следует отметить, что параллельное изучение зависимости скорости ферментативной реакции (или степени насыщения) и степени конформационных изменений от концентрации субстрата (или эффектора) позволяет, по-видимому, более надежно выбрать модель регуляторного фермента [109]. Подобный подход был использован, например, в работе Dur hslag и др. при изучении кооперативного связывания НАД дрожжевой D-глицеральдегид-З-фосфатде-гидрогеназой [110]. С помощью метода рассеяния рентгеновых лучей под малыми углами было показано, что переход от апо- к холоферменту сопровождается уменьшением объема молекулы на 7,08%. На рис. 39 представлена полученная авторами зависимость (Уа—V)l Va—Т ж) (где У а И Vx — объем молекулы фермента при степенях насыщения коферментом 0,0 и 0,99 соответственно, а V — объем молекулы при промежуточных степенях насыщения), которая характеризует степень конформационных изменений от [c.114]