Определение активности иммобилизованных ферментов

Компартментация метаболитов мембранной системой "экономит" растворитель в клетке (Хочачка, Сомеро, 1977). Из-за содержания в клетке большого количества различных молекул емкость внутриклеточной водной среды ограничена, поэтому многие ферменты в клетке находятся не в свободном состоянии, а иммобилизованы на мембранах. Со своим субстратом контактирует только активный центр фермента. В результате возрастает надежность функционирования муль-тиферментных комплексов. Встроенные в определенной последовательности в мембраны они участвуют в цепях последовательных превращений метаболитов. Примером могут служить электронтранспортные цепи в мембранах хлоропластов и митохондрий. [c.22]

Для удобства применения холинэстеразы иммобилизуют в по.шмер-ные пленки или гели. При этом существенно увеличивается устойчивость фермента к влиянию внешних факторов. Так, при иммобилизагщи холинэстеразы в желатиновый гель срок ее хранения составляет 2-3 года, а при непрерьганой работе активность препарата падает на 20% лишь через 10 дней. Наряд) с повьпиением стабильности иммобилизация хо.пинэстераз обеспечивает многократное использование препарата. Заметим, что при определении необратимых ингибиторов, например фосфорорганических пестицидов, повторное использование фермента в каждом случае требует специальных исследований В качестве реактиваторов применяют гидро-ксиламин, оксимы и др [c.290]

ПодготоЕ ленная путем модифицирования реакцией с -амино-пропилтриэтоксисиланом поверхность достаточно крупнопористого силохрома или силикагеля может быть использована для иммобилизации белков и, в частности, ферментов, нужных для проведения -биокаталитических реакций. Для этого, как указывалось в лек-дии 5, надо провести дальнейшее модифицирование поверхности адсорбента-носителя прививкой агента (глутарового альдегида), способного вступить в реакцию с аминогруппами как модификатора, так и балка. Адсорбент-носитель с привитыми теперь уже альдегидными концевыми группами вводится в реакцию с различными белками. Ра ссмотрим иммобилизацию уреазы — важного фермента, находящего также применение в аналитическом определении мочевины и в аппарате искусственная почка . На рис. 18.9 представлена зависимость активности иммобилизованной уреазы от количества иммобилизованного белка. Адсорбентом-носителем является макропористый силохром со средним диаметром пор 180 нм. Этот размер пор значительно превышает размер глобулы уреазы. Вместе с тем удельная поверхность этого силохрома еще достаточно высока (5 = 41 м /г), чтобы обеспечить иммобилизацию значительного количества уреазы. Из рис. 18.9 видно, что при этом удается иммобилизовать до 120 мг белка на 1 г сухого адсорбента-носителя (это составляет около 3 мг/м ). Активность уреазы снижается не более, чем наполовину, даже при большом количестве уреазы в силикагеле, зато иммобилизованный так фермент можно многократно применять в проточных системах, и он не теряет активности при хранении по крайней мере в течение полугода. [c.341]

Для иммобилизации ферментов применяют растворы полиэлектролитов, способные к фазовому разделению при определенных условиях. Запатентован способ иммобилизации большой группы ферментов (более 10) путем смешения растворов хитозана и фермента с последующим осаждением комплекса щелочью либо ионами SOl с полным сохранением ферментативной активности белка (пат. 4167447 США). Аналогичным способом с использованием хитозана была иммобилизована уреаза (пат. 80—74794, 1980 Япония). Из кислого раствора фермента и хитозана отливали пластинки, которые после высушивания выдерживали в боратном буфере. Полученная пластинка имела удельную активность 0,08 ед/см . С помощью водорастворимого карбоди-имида на хитозане иммобилизовали глюкозоизомеразу [102]. Таким образом, процесс иммобилизации не вызывает инактивации фермента, более того, такая обработка снижала степень инактивации фермента ионами металлов. [c.127]

Основные вопросы, связанные с иммобилизацией белков. При рассмотрении вопросов, связанных с иммобилизацией белков, в первую очередь необходимо отметить, что при иммобилизации белок частично денатурируется, то есть, по наиболее общему определению, изменяет в какой-то степени свои первоначальные (нативные) характеристики. Эти изменения происходят как под воздействием физико-химических условий синтеза (температура, состав и концентрация модифицирующего раствора), так и в результате ковалентной межмолекулярной сшивки. Поэтому условия синтеза гетероповерхностного сорбента, предназначенного для анализа биологических проб с прямым вводом, следует подбирать таким образом, чтобы, с одной стороны, не происходило значительных изменений нативной глобулярной структуры белка для создания максимально однородного внешнего покрытия частиц, а с другой — чтобы уже иммобилизованный белок был лишен детерминантных групп (активных центров) для устранения возможных биоспеци-фических взаимодействий с содержащимися в пробе белками. Хотя для иммобилизации используются преимущественно инертные белки (например, сывороточный альбумин), их инертность весьма относительна. Но, по крайней мере, такое допущение принимается по сравнению со специализированными белками. Примерно в половине работ, посвященных созданию селективных электродов и сорбентов при иммобилизации ферментов, последние иммобилизуются совместно с альбуминами или коллагеном, либо на их матрицы. [c.544]

Согласно другой процедуре, реагенты частично иммобилизуются для этого их вносят в раствор, полимеризующийся затем с образованием геля (например, геля агара, который помещают на поверхность электрофоретического геля) или ими пропиты-.вают фильтровальную бумагу. В этих случаях можно локализовать сложную цепь реакций, инициируемых определяемым фер- ментом, так как даже тогда, когда видимый продукт растворим, он не может быстро диффундировать наружу. Процессы, ана- логичные тем, которые протекают при измерении ферментативной активности сопряженными методами (см. разд. 8.3), тоже можно использовать для локализации ферментов так, образование или окисление NAD(P)H можно наблюдать в ближнем ультрафиолете (сине-зеленая флуоресценция). Для качественного обнаружения ферментов в геле часто применяют такие химические методы, которые обычно не используются для определения ферментативной активности в растворе. Например, освобождение фосфата под действием различных фосфатаз может быть замечено по появлению осадка фосфата кальция [192]. Если же этот осадок не очень отчетливо виден, то после отмывания избытка реагентов его можно превратить в фосфат евин- [c.328]

Наряду с цельными фрагментами тканей млекопитающих в биосенсорах можно эффективно использовать фракции тканевых клеток, иммобилизуя именно те субклеточные компоненты, которые обладают наибольшей биокаталитической активностью. Такой подход может быть весьма плодотворным, если необходимо увеличить количество иммобилизованного фермента или улучшить избирательность сенсора, устраняя мешающие ферменты, которые содержатся в других частях клетки. Показано, что некоторые субклеточные фракции можно использовать как аналитические реагенты. Так. для определения тироксина можно использовать микросомы печени крысы [34]. Первой удачной попыткой создания биосенсора на основе субклеточной фракции был биосенсор для определения глутамина [8]. В этом сенсоре митохондриальную фракцию клеток кортекса почки свиньи иммобилизовали на газоаммиачном датчике. Митохондрии содержат два изофермЬнта глутаминазы [15], активность которых и используют в глутаминовом биосенсоре. [c.53]

Термоанализ можно применять также и для эпизодического или непрерывного наблюдения за окружающей средой [7] как своего рода антитоксический контроль. При необходимости детектирования определенного токсического соединения в ферментной колонке термистора можно иммобилизовать определенное количество фермента, который ингибируется данным соединением. Тяжелые металлы, например Hg(lI), можно обнаружить уже при содержании до 0,2-10 % по их ингибирующему действию на иммобилизованную уреазу [7]. Концентрацию тяжелых металлов в пробе определяют сравнением температурного отклика на импульсный ввод субстрата (с избытком мочевины) до и после введения пробы. Затем специальной промывкой полностью восстанавливают активность уреазы, что позволяет проводить повторные анализы на той же ферментной колонке. В некоторых случаях можно применять ферменты, которые действуют непосредственно на определяемое вещество. Так, цианид определяют с пределом обнаружения 10 М, используя фермент родаминазу. Возможно даже прямое определение пестицидов и ингибиторов ацетитхолинэстеразы [c.470]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология