Иммобилизации белков методы

Иммобилизация аффинных лигандов на сополимере этилена и малеинового ангидрида (ЭМА) рассмотрена в обзоре Гольдштейна [23]. Метод связывания ферментов на таком сорбенте разработан Левиным и др. [40]. Белок присоединяется к ангидридным группам полимера своими аминогруппами [c.199]

Метод фотолитографии используется для получения поверхностей с пространственно разделенными биомолекулами (биочипы), которые используются для изучения взаимодействий белок — ДНК, поиска новых лекарств и др. [299,300]. На рис. 5.54 приведена схема иммобилизации молекул ДНК на поверхности золота по определенному шаблону. [c.252]

Принцип, положенный в основу методов RIA [91, 117], аналогичен принципу методов ELISA эти методы в основном различаются тем, что для мечения вместо ферментов применяются радиоактивные элементы (главным образом йод) [49]. Широко используемый вариант этого метода не предусматривает иммобилизацию одного из реагентов реакция проходит в растворимой фазе, поэтому очень важным дополнительным этапом является отделение меченых реагентов, участвующих в иммунокомплексах, от тех, которые не участвуют. Если антиген представляет собой белок, обычно проводят разделение иммунокомплекса, осаждая его антителами к иммуноглобулинам кролика (если специфические антитела к белку индуцированы у кролика) [49]. [c.108]

Аффинная хроматография основана на использовании равновесного состояния высокоспецифического связывания, встречающегося в биологических системах. Этот метод позволяет осуществлять такое разделение веществ, которое невозможно достичь с помощью других способов [19, 20, 22]. Суть метода заключается просто в иммобилизации одного из компонентов обратимо связывающейся системы на твердом носителе и последующем его взаимодействии с другим компонентом (компонентами) этой равновесной системы, приводящем к отделению сопутствующих примесей. Таким образом, разделение основано на специфическом связывании компонентов данной системы, а не на различиях в их физических и химических свойствах. Методы аффинной хроматографии хорошо разработаны. Они используются для разделения и очистки компонентов таких высокоспецифически связывающихся комплексов, как антиген— антитело, гормон—связывающий белок, фермент— лиганд. Основными факторами, определяющими процесс разделения, являются природа и химическая струк- [c.216]

Другим природным полимером, широко применяемым для иммобилизации ферментов, является коллаген — фибриллярный белок соединительной ткани животных. Существует три основных способа иммобилизации ферментов с помощью коллагена макромолекулярное комплексообразование, импрегнирование и электроосаждение. При макромолекулярном комплексообразова-нии коллаген диспергирует в водном растворе при низких (2,0— 4,5) или высоких (8,5—12,0) значениях pH, вносят фермент и инкубируют смесь в течение 15—20 ч. Затем раствор выливают тонким слоем на инертную подложку и высушивают. В результате получается ферментсодержащая белковая мембрана, имеющая структуру трехмерной сетки из переплетенных фибрилл коллагена. Способ макромолекулярного комплексообразования неприменим для иммобилизации ферментов, неустойчивых в кислых или щелочных растворах, поскольку он требует длительной инкубации фермента в среде с экстремальными значениями pH. Этого затруднения можно избежать, если проводить иммобилизацию методом импрегнирования, при котором раствором фермента пропитывают уже готовую коллагеновую мембрану. [c.60]

Основой любого фермента является белок, представляющий собой компактную конструкцию из одной или нескольких полипептидных цепей, ковалентно связанных (сшитых) дисульфид-ными мостиками. Помимо белка ферменты иногда мо1ут содержать и небелковые компоненты простетические группы неорганической и органической природы, липиды (в липопротеидах) и углеводы (в гликопротеидах). Конечно, в общем случае химические методы иммобилизации нацелены на модификацию функциональных групп в белковой части молекулы фермента. Однако при выборе процедуры иммобилизации для конкретного фермента целесообразно учитывать и специфические особенности строения его молекулы. В этой связи укажем на хорошо известный и яркий пример ковалентной иммобилизации гликопротеидов. Относительно простым методом — окислением перйодатом натрия в мягких условиях — в полисахаридную часть фермента вводятся альдегидные группы, посредством которых на следующем этапе и осуществляется химическое взаимодействие с носителями или сшивающими агентами, содержащими аминогруппы (образованием азометиновых связей, оснований Шиффа). [c.82]

Применение аффинной хроматографии в качестве метода изучения взаимодействий находится еще на ранней стадии развития, несмотря на то что количественная аффинная хроматография была введена уже десять лет назад [1—3]. Действительно, количество исследований, касающихся методологических аспектов аффинной хроматографии, примерно равно количеству сообщений по применению этого метода в конкретных экспериментальных системах. Большинство этих исследований способствовало применению аффинной хроматографии для оценки равновесия с участием ферментов и модификаторов, ингибиторов или субстратов [1—12], но метод был также использован и для характеристики взаимодействий белок — лекарственный препарат [13], система антиген — антитело [14] и, в меньшей степени, белок-белковых взаимодействий [15, 16]. По существу метод заключается в иммобилизации биоспецифической реагирующей группы X на инертной хроматографической матрице (например, часто на сефарозе) и определении средневзвешенных величин объема элюирования Уа распределяющегося растворенного вещества А в ряде хроматографических экспериментов, в которых растворенное вещество мигрирует в присутствии различных концентраций лиганда 5, также специфически взаимодействующего с А и/или X, В некоторых примерах различные изменения значения Уа отражали конкуренцию между растворенными и иммобилизованными реагентами за одно и то же положение в А [2—5, 7—14] в других изменения в величинахГд были обусловлены наличием взаимодействия иммобилизованного реагента X с бинарным А5-комплексом, образованным растворенным веществом и растворимым лигандом [1, 6]. Цель количественной аффинной хром ографии — объяснить возникновение изменений в величинах Га в предложении существования тех или иных равновесий. Поскольку положение равновесия зависит от концентрации (в соответствии с законом действия масс), точное определение состава смеси реагентов, к которой относится Га, обеспечивает применение фронтальной хроматографии [3, 4]. [c.192]

Первые попытки достижения воспроизводимости анализов биологических жидкостей при прямом вводе пробы связаны именно с непосредственной белковой сорбцией на сорбенте. Так, еще в 1982 г. X. Йошида с сотр. предложили вариант обработки колонок, заполненных обращенно-фазовым сорбентом is (20-30 мкм, dp = 12 нм), путем пропускания раствора БСА или плазмы кролика в метаноле при pH = 3. После повторной промывки метанолом для удаления денатурированного неадсорбированного белка колонку использовали для анализа плазмы крови [102, 103]. Однако такая обработка колонок приводила к существенному снижению эффективности разделения, особенно при применении метода к мелкозернистым (5 мкм) сорбентам. Наряду с этим время жизни таких колонок было сравнительно коротким, что неудивительно, поскольку динамическое модифицирование белком проводили в неравновесных условиях, а денатурированный и химически незакрепленный белок удерживался только адсорбционными силами. Поэтому в более поздних разработках эти авторы использовали колонки, приготовленные таким образом лишь для предварительного концентрирования в системах с переключением колонок при анализе плазмы крови с прямым вводом [104, 105]. Дальнейшая работа этой группы [49] связана, в основном, с иммобилизацией авидина и овомукоидов на активированных ХМК и применением последних в сложных автоматизированных системах для анализа биологических жидкостей. [c.555]

В целом, введение аффинных меток в виде обсуждавшихся выше пептидных и полипептидных последовательностей существенно облегчает очистку меченых таким образом рекомбинантных белков, а также предоставляет дополнительные возможности наблюдать за эффективностью экспрессии рекомбинантных генов. Выбор для этих целей системы очистки зависит от конкретного белка, который предстоит получать в очищенном состоянии, а также от целей его дальнейшего использования. В ряде современных систем в рекомбинантные белки вводится двойная аффинная метка, одна из которых служит для очистки белка, а другая - для мониторинга за его биосинтезом. Также с помощью двойной метки может быть достигнута большая степень очистки рекомбинантных белков. Разработаны множественные аффинные аминокислотные последовательности, которые включают в себя кальмодулин-связывающий пептид, специфический сайт расщепления протеиназой и белок А для иммобилизации всей рекомбинантной конструкции. С помощью этих систем удается изучать белок-белковые взаимодействия путем выделения соответствующих белковых комплексов при исследованиях протеома [183, 184]. Методы иммобилизации белков с помощью аффинных последовательностей используются при создании пептидных и белковых микрочипов, клонотек на их основе, для адресной доставки белков и во многих других приложениях. О некоторых из них будет дополнительно рассказано в разделе П.3.2. [c.132]

Для связывания с белком водорастворимый полимер должен иметь группы, способные взаимодействовать с функциональными группами белка в условиях, не вызывающих денатурацию последнего. В подавляющем большинстве случаев это реакции в водных растворах при pH = 6—8, реже 3—10. Химические методы при этом в основном те же, что применяются при иммобилизации ферментов [6], а также для связывания с полимером низкомолекулярных ФАВ. В белке для взаимодействия с полимером-носителем используют главным образом аминогруппы. Участие в реакции тиольных групп не всегда желательно, так как их в белках немного и они часто существенны для физиологической активности. Белок может быть предварительно обогащен тиольными группами, например обработкой Ы-ацетил-гомоцистеинтиолактоном, после чего его связывают с полимером. Карбоксильные и ароматические группы белка используются редко, так как в первом случае приходится активировать белок, после чего возникает возможность его сшивания, а во втором — нередко наблюдается снижение физиологической активности белка из-за изменения структуры его гидрофобных областей. [c.162]