Теория аффинной хроматографии

Теория аффинной хроматографии [c.20]

СТАТИСТИЧЕСКАЯ ТЕОРИЯ ХРОМАТОГРАФИИ ПРИМЕНИТЕЛЬНО К АФФИННОЙ ХРОМАТОГРАФИИ [c.43]

Поскольку многие ферменты обладают большим сродством к субстратам в переходном состоянии, именно иммобилизованный аналог субстрата, имитирующий его переходное состояние, используют в качестве лиганда при аффинной хроматографии. В основе этой концепции лежит одно из главных положений теории ферментативного катализа, впервые выдвинутое Л. Полингом, в соответствии с которым активный центр фермента должен быть в большей степени комплементарен форме субстрата, находящейся в переходном состоянии, т.е. претерпевшей предварительные структурные перестройки на пути превращения в продукт реакции, но не в основном исходном состоянии [99]. [c.347]

Белки обычно избирательно адсорбируются на твердых фазах самых разных типов. Поэтому адсорбционные методы, особенно колоночная хроматография, широко используются для разделения белков. Применение таких методов часто позволяет получить наибольшую степень очистки белков, что в случае фе рментов означает максимально возможное повышение их удельной активности. Хотя колоночная хроматография служит идеальным способом оптимального разделения белков, не следует забывать и о методах адсорбции в объеме , так как это очень быстрые и потому весьма полезные методы, когда время имеет первостепенное значение (см. также гл. 7). Важнейшими адсорбентами белков являются ионообменники, фосфат кальция (в виде геля или в кристаллической форме) и разнообразные аффинные адсорбенты, созданные для ферментов определенных типов. Все эти вопросы вслед за общим введением в теорию адсорбционной хроматографии обсуждаются в данной главе применительно к выделению белков. [c.91]

Теории межмолекулярных сил рассмотрены в предыдущей книге этой серии [1]. Здесь мы остановимся только на некоторых полезных для практики качественных представлениях. Хотя все взаимодействия — межмолекулярные и химические— имеют общую квантовомеханическую основу, их удобно условно разделить на отдельные виды (табл. 3.1). В разных вариантах хроматографии, а именно в газовой и в молекулярной жидкостной (столбцы 1—5 в таблице), в хроматографии с образованием комплексных соединений (лигандной, столбцы 6—9), в ионообменной (столбцы 10 и 11) ив биоспецифической (аффинной, столбцы 12—14) хроматографии используются разные виды физических и химических взаимодействий (отмечены крестиками). Простейший случай — это неспецифическое дисперсионное притяжение (строка I и столбец 1). Неспецифическое взаимодействие может также включать комбинацию (столбец 2) дисперсионного (строка I) и индукционного (строка И) притяжения, если в структуре компонента либо неподвижной фазы имеются ионы, жесткие диполи, квадруполи и т. д. [c.25]

В отношении ионообменной хроматографии важно отметить еще несколько моментов. Хотя, согласно простым теориям, условия элюции прямо противоположны условиям адсорбции, на практике часто наблюдается гистерезис. Особенно это характерно для фосфоцеллюлозы, но отмечается также и при работе с другими адсорбентами, такими, как аффинные и модифицированные красителем лигандные адсорбенты (разд. 4.5 и 4.6). Гистерезис означает, например, что величина а, наблюдающаяся при использовании в процессе адсорбции того или иного буфера с определенной ионной силой, будет отличаться от величины а, когда тот же буфер используют для элюции. Так, на рис. 4.21 ионная сила А вполне достаточна для адсорбции, тогда как ионная сила В мала для элюции и слишком велика для адсорбции. Эти эффекты можно объяснить тем, что данные процессы неидеальны и неравновесны кроме того, здесь действуют и другие факторы, не учитываемые простой теорией. [c.132]

Приложение теории хроматографии к аффинной адсорбции [c.153]

Теорию, изложенную в разд. 4.1, можно применить к адсорбционной хроматографии и сделать при этом некоторые интересные выводы. Поскольку константа диссоциации комплекса адсорбента с белком (Кр) должна быть близка к константе диссоциации комплекса белка с лигандом или каки.м-то образом связана с ней, можно легко рассчитать величину коэффициента распределения. Один из недостатков аффинных адсорбентов заключается в том, что, хотя степень модификации может быть достаточно высокой (1—10 мкмоль-см ), только незначительная часть иммобилизованного лиганда оказывается ориентированной должным образом даже при наличии удлиняющего мостика обычно только 1—2% общего числа центров связывают белок. Хорошей считается емкость в 1—2 мг-см что для белка с мол. массой 100000 соответствует величине /п/ от 0,01 до 0,02 мМ. Если допустить, что равно 0,02, а рг — 0,01 в уравнении (4.5), то можно вычислить величины а для различных значений Кр, данных в табл. 4.7. [c.153]

Я бы хотела выразить свою глубочайшую признательность профессору кафедры 3-го лечебного отделения медицинского факультета Карлова университета (Прага) Карелу Мацеку за постоянный интерес к данной книге, который он проявил при ее написании, а также за ценные советы и замечания, которые очень помогли мне. Я благодарю также профессора кафедры Института органической химии и биохимии Чехословацкой академии наук (Прага) Карела Благу за любезное согласие ознакомиться с рукописью и многие цепные предложения. Профессору кафедры Пенсильванского университета (Филадельфия) Дэвиду Дж. Грейвсу и профессору Токийского университета Акиоши Вада я благодарна за ознакомление с главой, посвященной теории аффинной хроматографии, и полезные замечания. Я благодарю доктора Же-лимира Прохазку за перевод рукописи па английский язык. Я также благодарна Владимиру Маржику за подготовку рисунков. [c.8]

Приложение статистической теории хроматографии, развитой Гиддингсом и Эйрингом (теория тарелок), к аффинной хроматографии осуществлено Денизо и Делаажем [2]. С помощью удобных выражений установлены моменты приближения к распределению Лапласа — Гаусса. Гауссовский характер не сохраняется, если принимать во внимание другие причины дисперсии, но выражение в общем виде может быть получено. Эти авторы также нашли простой способ выражения фундаментальных констант для модели, основанной только на экспериментальных данных. [c.43]

Первоначально количественная аффинная хроматография ограничивалась определением констант ассоциации для систем, в которых распределяющееся вещество А, находящееся в растворе, имело только одно положение для взаимодействия с X и/или S, но последующее развитие метода [17—19] дало возможность учитывать и мультивалентность растворенного вещества. Существующая теория, однако, ограничена или системами, в которых не происходит распределения растворенного вещества по гелю, или системами с достаточно небольшим лигандом, что позволяет считать хроматографические распределительные характеристики для А и всех АЗгКОмплексов очень близкими. Первый отмеченный случай, вероятно, наблюдается, когда и растворенное вещество и лиганд — макромолекулярные соединения при этом можно выбрать подходящий аффинный адсорбент, исключающий реагент большей молекулярной массы. Хотя теория мультивалентных растворенных веществ должна, разумеется, включать также и специальный случай одновалентного вещества, концепции количественной аффинной хроматографии легче понять при первоначальном рассмотрении простейших ситуаций. [c.193]

Хотя представления, положенные в основу этого обзора, несомненно, пригодны для изучения большого числа взаимодействий, их ни в коем случае нельзя считать подходящими абсолютно для всех систем. Например, ситуация, когда может происходить взаимодействие как А, так и его комплекса с лигандом и матрицей (/гдх и /гдзх — истинные константы), не рассматривалась в настоящем обзоре для этой ситуации предложена более сложная теория [19]. Однако, допуская, что единственная истинная константа ассоциации описывает все взаимодействия особого типа между растворенным веществом и матрицей, мы существенно ограничиваем область применения современных методик в количественной аффинной хроматографии с мультива-лентными растворенными веществами [18, 19]. Нетрудно представить себе, что последовательные взаимодействия растворенного вещества с матрицей могут характеризоваться увеличением или уменьшением констант связывания ввиду изменения стери-ческих факторов, связанных с расположением иммобилизованных групп X. Другой, уже обсуждавшийся аспект, ограничивающий применение настоящих методик, связан с допущением идентичности характеристик распределения в геле растворенного вещества и всех комплексов растворенное вещество — лиганд. Кроме того, совершенно не принимались во внимание кинетические соображения (химических процессов и массопередачи), касающиеся процесса распределения. В этом отношении более общая теория количественной аффинной хроматографии [34 показала, что ограничение значений констант скорости, вызванное предполагаемым достижением распределительного равновесия, вероятно, не имеет значения для исследований обычной колоночной хроматографии, но может сделать невозможным применение представленных выше выражений к результатам, полученным при высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием больших скоростей потока. Как отмечено в работе [35], возможное использование аффинной хроматографии для количественных исследований связывания лиганда, несом- [c.215]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология