Прямое определение гистидина

Прямое определение гистидина 55 [c.55]

Следует напомнить об известных трудностях идентификации функциональных групп активных центров ферментов по величинам рК, полученным из изучения зависимости скорости реакции от pH. Во-первых, одна и та же группировка в белках разного строения может иметь неодинаковое значение рК из-за влияния соседних групп. Некоторую помощь в этом случае может оказать измерение теплоты диссоциации ионогенных групп, рассчитываемой по измерениям температурной зависимости рК. К сожалению, для холинэстераз эти термодинамические константы достаточно надежно не измерены. Согласно данным Шукудза и Шинода [122], теплоты диссоциации основной группировки ацетилхолинэстеразы эритроцитов и холинэстеразы сыворотки крови человека составляют соответственно 8,5 и 6,5 ккал1моль. Эти величины выше или ниже найденной для диссоциации имидазольной группы гистидина в других белках (6,9—7,5 ккал моль [123]). Если признать, что в обеих холинэсте-разах в качестве основной группировки активного центра выступает имидазол гистидина, то трудно понять столь существенное различие в величинах теплот диссоциации. Во-вторых, даже если измерение активности фермента при разных pH рассматривать в качестве своеобразного титрования функциональных групп активного центра, то полученные результаты нельзя безапелляционно считать отражением прямого участия этих групп в каталитическом акте. Можно представить, что ионы Н и ОН -среды выполняют свою функцию, вызывая не только протонизацию или депротонизацию функциональных групп активного центра, но также и более общую функцию создания и поддержания специфической для каждого фермента третичной структуры. Можно думать, что в создании третичной структуры фермента большую роль играют ионные связи между такими группировками, которые расположены вне активного центра и непосредственно не участвуют в реакции с субстратом. Такие ионогенные группировки при взаимодействии могут сближать друг с другом (или наоборот удалять друг от друга) определенные функциональные группы белка, которые непосредственно участвуют в каталитическом акте. Внешне эта непрямая роль кислотно-основных группировок фермента будет отражаться в форме обычной зависимости кинетических констант (и, V, Кт) от pH, но по существу такая зависимость не дает оснований для решения вопроса, является ли она следствием влияния pH на конформацию белка в районе активного центра или диссоциацию группировки, прямо участвующей в реакции с субстратами. [c.184]

Конечно, прямой доступ к иону железа для лигандов закрыт аминокислотами, особенно дистальным гистидином. Как уже отмечалось, один из атомов азота имидазольного кольца гистидина обращен к железу, а другой фактически находится на поверхности, так что этот гетероцикл может работать как своего рода люк, перекрывающий лигандную полость. Поэтому связывание любого лиганда представляет собой сложный процесс, включающий промежуточные изменения конформации белка, например поворот гистидина Е7 вокруг его связи Са —Сз или небольшое искажение структуры спирали Е [161]. Тем не менее скорость связывания кислорода исключительно велика. Константа скорости реакции второго порядка при 20°С для различных миоглобинов находится в интервале 1,0-10 — 1,9-10 дм -моль с [определенные к настоящему времени значения свободной энергии активации для этих процессов составили в трех случаях 23,0, 23,0 и 29,3 кДж/моль (5,5, 5,5 и 7,0 ккал/моль) соответственно], а константы скорости для изолированных, но слегка модифицированных а- и 3-цепей составили 5-10 — 8-10 дм моль с , тогда как для мономерного гемоглобина hironomus получено более высокое значение 3-10 дм -моль 1-с [6]. Для гемоглобйнов кинетика реакции имеет сложный характер вследствие изменений четвертичной структуры, однако константы скорости и в этом случае попадают в интервал 10 — 10 дм моль с . Константы скорости отщепления кислорода составляют 10—70 с , а соответствующие энергии активации равны 80—88 кДж/моль (19—21 ккал/моль) для миоглобинов и 10— 15 с и 67—105 кДж/моль (16—25 ккал/моль) для большинства гемоглобйнов (эти значения сильно зависят от pH). Библиографию по этому вопросу см. в работе [8]. Даже если гистидин существенно уменьшает величину константы скорости, которая была в отсутствие белка, наблюдаемые скорости вполне достаточны для физиологических потребностей. Мутантные гемоглобины, в которых гистидин замещен на аргинин или тирозин, обнаруживают несколько более высокие скорости, особенно в реакциях с СО [8]. Некоторые гемоглобины с очень малыми константами скорости диссоциации ( 10 с 1), которые явно не могут функционировать как переносчики кислорода, встречаются у нематод [91]. [c.163]

Нами сделано предположение о том, что ароматические и основные аминокислоты образуются в растениях пе путем прямого взаимодействия между аммиаком и соответствующими органическими кислотами, а в результате реакций переаминиро вания. Для доказательства высказанного предположения были проведены опыты по изучению образования в растениях отдельных аминокислот. По условиям опыта растения выращивались в течение определенного времени на питательной смеси, содержащей аммиак, после чего аммиак исключался из питательного раствора. В этих опытах образование триптофана и гистидина в растениях было обнаружено только через 30—40 часов после того, как весь поглощенный растениями аммиак был переработан растениями в процессе синтеза аланина и дикарбоновых аминокислот. При некотором избытке поступающего в растение аммиака происходит образование аспарагина, в результате амидирования асиарагиноеой кислоты. [c.55]

Кроме вариабельности в содержании непосредственно белков, что в той или иной степени отражается на содержании аминокислот, имеет большое значение видовая или сортовая вариабельность аминокислот одного и того же продукта. Кроме того, в отличие от метода определения белков метод определения аминокислот дает значительно большой вклад в общую вариабельность аминокислотного состава. Выше бьши подробно рассмотрены причины расхождений в аминокислотном анализе, в том числе проведение одного гидролиза вместо пяти, отсутствие анализа стандартных образцов продукта и внешнего стандарта и т. д. В результате в высокобелковых продуктах (мясо, рыба, птица, зерно и зернобобовые) при определении лизина, лейцина, изолейцина, треонина, валина, аргинина, глицина, пролина, серина, гистидина, аспарагиновой и глутаминовой кислот, фенилаланина, аланина, тирозина, общий коэффициент вариации (относительное среднеквадратичное отклонение) равен 10%, при определении метионина — 15 %, триптофана и цистина — 25% [12]. Для низкобелковых (овощи и фрукты) вариабельность значительно выше — 20, 25 и 30% соответственно [12]. Эти расчеты хорошо совпадают с прямыми экспериментальными данными по межлабораторному испытанию определения состава аминокислот ряда высокобелковых продуктов (казеин, белок яиц, соя, [c.287]

Пики 2 и 3 были идентифицированы Марклеем (Markley, 1975) на основании исследова-ний методом ЯМР кинетики медленного обмена протона на дейтерий при С2-атоме четырех остатков гистидина. Каждый из остатков характеризуется своей кинетикой обмена, которую можно сравнить с результатами, полученными в эксперименте другого типа, где измеряли включение трития в эти четыре остатка. В последнем случае после инкубации фермента с тритием выделяли радиоактивные пептиды и определяли непосредственно степень обмена для каждого остатка гистидина. Эти два типа данных по кинетике обмена можно прямо сопоставить между собой и соотнести константу скорости, определенную с помощью ЯМР для какого-то пика, с константой скорости одного из остатков гистидина, определенной другим методом. Результаты показали, что His-12 соответствует пику 3, а His-119 — пику 2. Эти и другие данные указывают на то, что пики 4 и 1 можно отнести к остаткам His-48 и His-105 соответственно. [c.77]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология