Радиоактивные пептиды

Рис. 147. Нарастание радиоактивности пептидов, последовательно расположенных вдоль а-цепи гемоглобина при разном времени импульса радиоактивного лейцина.

Если удается выделить в клетке какой-то один преимущественно протекающий синтез одного определенного белка, то но интенсивности и скорости включения меченых аминокислот можно проследить, с какой скоростью и в каком направлении идет этот процесс. Так, при исследовании биосинтеза гемоглобина на ретикулоцитах показано что этот белок синтезируется путем последовательного удлинения молекулы в направлении от амино- к карбоксильному концу молекулы. Этот факт был подтвержден данными о радиоактивности пептидов, полученных после ферментативного гидролиза синтезированного гемоглобина. [c.482]

После определения содержания искомого пептида в пробе и его радиоактивности, можно рассчитать концентрацию данного соединения в биологической пробе. Это можно сделать, определяя отношение радиоактивности к оптическому поглощению меченого стандарта и сравнивая его с таким же соотношением в рабочем растворе. Естественно, что при наличии в пробе немеченого пептида это соотношение будет падать. [c.532]

Количество связанного лиганда определяется в зависимости от его природы с помощью методов, основанных, как правило, на освобождении аффинного лиганда в результате щелочного или кислотного гидролиза. Анализируя пептиды, удобнее всего определять количество аминокислот после кислотного гидролиза [3]. При использовании радиоактивного лиганда целесообразно проводить измерение радиоактивности. Концентрацию связанного аффинного лиганда удобнее выражать числом микромолей этого лиганда, приходящимся на 1 мл набухшего в колонке геля, а не на 1 г сухого носителя. [c.12]

Реакционный сосуд, впервые описанный Мэррифилдом [71], показан на рис. 24. Этот реактор (основные размеры указаны) нашел широкое применение и в общем оказался удовлетворительным. При его применении в комплексе с устройством, обеспечивающим поворот сосуда на 105° (по часовой стрелке от исходного положения, указанного на рисунке), смола эффективно перемешивается и при правильной подаче растворителей (см. стр. 89) всю смолу можно удовлетворительно промыть и вновь ввести в реакцию. Реакционные сосуды этого типа изготавливались и очень большого размера [56], пригодного для работы с 50 г полимера-носителя, и в микроварианте последний представлял собой короткий отрезок тефлоновой трубки, насаженный на маленький пористый диск и имеющий кран на одном конце и пглиф — на другом этот микрореактор использовали для работы с несколькими миллиграммами радиоактивных пептидил-полимеров [121]. [c.147]

Радиоактивные пептиды идептифицируют с помощью проточных счетчиков или чаще измерением радиоактивности во фракциях с помощью подходящих гамма- или жидких сципциляцион-ных счетчиков. [c.240]

Пики 2 и 3 были идентифицированы Марклеем (Markley, 1975) на основании исследова-ний методом ЯМР кинетики медленного обмена протона на дейтерий при С2-атоме четырех остатков гистидина. Каждый из остатков характеризуется своей кинетикой обмена, которую можно сравнить с результатами, полученными в эксперименте другого типа, где измеряли включение трития в эти четыре остатка. В последнем случае после инкубации фермента с тритием выделяли радиоактивные пептиды и определяли непосредственно степень обмена для каждого остатка гистидина. Эти два типа данных по кинетике обмена можно прямо сопоставить между собой и соотнести константу скорости, определенную с помощью ЯМР для какого-то пика, с константой скорости одного из остатков гистидина, определенной другим методом. Результаты показали, что His-12 соответствует пику 3, а His-119 — пику 2. Эти и другие данные указывают на то, что пики 4 и 1 можно отнести к остаткам His-48 и His-105 соответственно. [c.77]

В тех случаях, когда ГАФД обрабатывали радиоактивным йодом в 6 М мочевине, в радиоавтограммах наблюдали 4 радиоактивных пептида и сильно меченное соединение (рис. 13, М2). Как показало спектрофотометрическое определение, все эти радиоактивные пептиды содержала дийодпроизводные. Аминокислотный анализ показал, что пептиды № 1 и 2 являются гомологами (табл. 8), которые [c.78]

КМ-альдолазе распределены в равной степени во всех 4 лолипептидных цепях — предположение, которое не было еще доказано. Анализ этих данных позволяет предсказать, что на ранней стадии карбоксиметилирования будет реагировать только один остаток цистеина на 1 субъединицу, а лроизводное, содержащее 10 КМ-групп, будет давать при гидролизе 3 радиоактивных пептида. Это предположение было подтверждено путем анализа. [c.366]

Таким образом, в целом альдолаза содержит 7-КМ-ци-стеинилпептидов. На рис. 83 показаны радиоактивные пептиды 10-КМ- и 4-КМ-аль-долазы. В активной 4-КМ- [c.367]

Методы анализа фракций могут быть физическими, химическими и биологическими. Одним из лучших методов считается детектирование радиоактивных изотопов. Результаты измерений оформляют в виде кривой зависимости определяемой величины от объема злюата. По распределению пиков на хроматограмме судят о возможности объединения некоторых фракций, совершенно чистых, без примесей других компонентов. Методом ионообменной хроматографии можно разделять различные катионы и анионы, четвертичные аммониевые основания, амины, аминокислоты, белки, продукты гидролиза пептидов, физиологические жидкости, гидролизаты клеточных оболочек микробов, антибиотики, витамины, нуклеиновые кислоты. [c.361]

Этот выбор диктуется характером задачи, которая решается гель-фпльтрацией, и свойствами разделяемых молекул, в первую очередь их массами. Для обессоливаиия раствора макромолекул естественно использовать жесткие, достаточно мелконористые матрицы с крупными гранулами (последнее — для увеличения скорости течения), например сефадекс С-25 или биогель Р-б. Для обессоливания более мелких молекул можно воспользоваться сефадексами С-10 и С-15 или биогелями Р-2 и Р-4. Названные матрицы удобны и для смены буфера, в котором первоначально находится препарат, на тот, которым уравновешена колонка и производится элюция, или для освобождения биополимеров от радиоактивных низкомолекулярных предшественников. Близка к описанным н задача рассортировки смеси на две группы веществ — высокомолекулярных и низкомолекулярных (например, отделение белков от пептидов или нуклеиновых кислот от белков). Здесь, очевидно, следует вы- [c.133]

Описано фракционирование радиоактивно меченных пептидов трипсинового гидролизата белка на колонке Spherisorb ODS (0,46 25 см) линейным градиентом (0—62,5%) этанола в 4,5%-ном растворе НСООН. Фракционирование вели при температуре 40° со скоростью элюции 1,4 мл/мин в течение 95 мин [Smart et al., 1981]. В растворах с высоким содержанием этанола (как и ацетонитрила) растворимы ие все пептиды. Хроматографию труднорастворимых пептидов иногда удается осуществить, используя в качестве органического растворителя пропанол. В силу своей большей, чем у этанола, гидрофобности пропанол элюирует с октадециловых колонок даже крупные пептиды при концентрации менее 20%. Относительно высокая вязкость пропанола заставляет снижать скорость элюции, но для крупных пептидов это все равно необходимо делать ввиду их замедленной диффузии. [c.202]

Изящная комбинация химической модификации с ионообменной хроматографией была использована для быстрого отбора из совокупности пептидов, полученных после трипсинового гидролиза, тех из них, которые содержат Met. Смесь трипсиновых пептидов растворяли в 30%-ной СН3СООН и обрабатывали радиоактивно меченным иодацетамидом. На атоме серы метионина возникал дополнительный положительный заряд, поэтому при хроматографии на сильном катионообменнике такие пептиды задерживались но сравнению с нормальным положением их элюции. По наличию метки со- [c.298]

Что касается детектирования пептидов флюоресцентными методами, то несолшенный интерес представляет недавнее предложение использовать для этой цели хорошо знакомый по методу регистрации радиоактивности сцинтиллятор ППО (2,5-дифенилоксазол). В цитируемой работе при ТСХ пептидов во втором направлении на пластинках, покрытых целлюлозой <СНдСООН—вода в пропорции 15 10 3 12) растворяли ППО до концентрации 5 г/л. При освещении высушенной пластинки коротковолновым УФ-све- [c.489]

Один нз методов идентификации Л -концевой аминокислоты пептида нли белка состоит в замещении -аминогруппы иа такую груп-. пу, которая выдерживает гидролиз, и таким образом, после кислотного нлн ферментативного гидролиза меченую аминокислоту можно обнаружить спектрофотометрнчески, спектрофлуорометри-чески илн по радиоактивности и идентифицировать с помощью хроматографии. [c.264]

В результате образуется производное карбоксиметилцистеина. Если в этой реакции использовать С- Вг- или С-1- ацетат, то, помимо разрыва S —S-связей и блокирования возникающих 8Н-групп, можно радиоактивно пометить пептиды, содержащие цистеиновые остатки. [c.34]

Другой весьма примечательный пример изучения ответственных пептидов можно найти в истории исследования эстераз. Янсен и др. [39] обнаружили, что в эквимолярных концентрациях дии-зопропилфторфосфат (ДИПФФ) способен необратимо подавлять активность некоторых протеаз и эстераз. Из гидролизатов этих ферментов удалось выделить и расшифровать структуру тех пептидов, с которыми связывается радиоактивный ингибитор. Результаты этой расшифровки представлены в табл. 7. У всех сравниваемых ферментов аминокислотные остатки, расположенные вблизи заблокированной ДИПФФ боковой цепи, содержащей серии, оказались идентичными или сходными. Это сопоставление также подтвердило справедливость принципа сходная структура— сходная функция . В химии белков этот принцип следует принимать с известной оговоркой аналогичной структуре не всегда соответствует тождественная функция, а чаще всего похожая или генетически близкая. Сходные структуры могут быть генетически близкими и возникать, например, от общего предшественника путем замены аминокислот в результате изменения одного основания в их кодоне. [c.41]

Предварительное фракционирование на колонке с сефадексом очень удобно для выделения и очистки компонентов смеси, избирательно помеченных радиоактивными изотопами. В этом случае кроме определения концентрации пептидов спектрофотометрией или с помощью нингидриновой реакции, измеряют также радиоактивность полученных фракций в соответствующем приборе (в сцинтилля-ционном или других счетчиках). [c.228]

Уменьшение количеств белков и пептидов, необходимых для анализа их структуры, является одной из центральных проблем, стоящих перед исследователями. С целью ее решения ведется поиск новых методов изучения структуры, в частности более чувствительных способов идентификации производных аминокислот (см. с. 61). Один из перспективных подходов заключается в широком использовании радиоактивных методов анализа. В ряде лабораторий при деградации пептидов в секвенаторе применяется радиоактивный или С-ФИТ1Д. Можно вводить радиоактивную метку непосредственно в анализируемый белок. Для многих белков это достигается добавлением радиоактивно меченных аминокислот непосредственно в питательную среду, на которой выращивается культура, являющаяся источником исследуемого белка. Таким же путем оказывается возможным радиоактивно метить белок избирательно по определенным аминокислотным остаткам. Если белок, радиоактивно меченный, например, по остаткам лейцина, анализировать с помощью секвенатора, то простое измерение радиоактивности экстрактов, содержащих анилинотиазолиноны, позволяет безошибочно определить, в каких положениях полипептидной цепи в N-концевой области белка расположены остатки лейцина (рис. 31). Аналогичным образом можно определить положение и других аминокислотных остатков. Такой прием используется для анализа N-koh-цевой последовательности предшественников белков, доступных лишь в ничтожно малых количествах. Для исследования полной структуры он, однако, не применяется из-за дороговизны и трудоемкости. [c.79]

Известно более 40 производных аминокислот, при помощи которых можно определять Ы-концевые остатки аминокислот в пептидах и белках. Однако эти соединения редко идентифицируют методом жидкостной хроматографии обычно удовлетворяются качественным анализом при помощи тонкослойной хроматографии. При этом с целью облегчения детектирования стремятся использовать окрашенные флуоресцирующие или радиоактивно меченные реагенты. В качестве примера можно привести 3,5-динитрофенилизо йоцианат [32—34] и 4-дИметила-мино-3,5-динитрофенилизотиоцианат [32—35]. Много внимания было уделено вопросу применения в аналитической химии белка меченого иодбензол-п-сульфонилхлорида (пипсил-хлорида) [36, [c.384]

Колонки (20X5 мм уравновешивались u.uo AL боратным буфером (рН 2,0), содср . 2щ . 10 ммоль/л СаСЬ. Триптические гидролизаты модифицированной нуклеазы (1,7 мг) наносились в 0,5 -МЛ того же буфера После пропускания через колонку 10 мл буфера связавшиеся пептиды элюировались раствором аммна ка (pH 11,0) начало элюирования указано стрелкой, 1 — оптическая плотность при 280 нм 2 — радиоактивность. [c.128]

При иодировании тирозина последовательно образуются моно- и дииодтирозин (соответственно МИТ и ДИТ). Введение второго атома иода протекает с более высокой скоростью, по этому ДИТ является основным продуктом реакции. Степень замещения и распределение иодтирозина в пептидах, полученных после гидролиза белка, определяют по включению радиоактивной метки, а также методом дифференциальной спектрофото-метрии. [c.353]

В литературе по биохимии есть примеры применения электрофореза на бумаге для разделения смесей аминокислот и пептидов [4, 6, 7] и олигонуклеотидов [8—10]. В качестве метода регистрации радиоактивности чаще всего, особенно для двумерных электрофоре-тограмм, используют авторадиографию, хотя некоторые исследователи предпочитают радиосканирование. [c.135]

Фосфорильная группа присоединяется к энзиму необратимо и не удаляется диализом, при денатурации или гидролизе. Получив ДФФ-производное белка и осуществив гидролиз его, можно затем выделить пептид, к которому присоединен ДФФ. Задача облегчается, если берут ДФФ, меченный изотопом фосфора,— тогда из хроматографически разделенной смеси пептидов отбирается пептид, который обладает радиоактивностью. Проведя затем полный гидролиз этого пептида, можно установить аминокислотный состав активного центра фермента. С помощью этого приема, первоначально на химотрипсине, было показано, что ДФФ реагирует с ОН-группой одного из сериновых остатков [c.73]

Ввиду биологической важности производных адениловой кислоты основное внимание было сосредоточено на ацил- и аминоацил-ангидридах аденозин-5 -фосфата. Однако в клетках асцитной карциномы Эрлиха было обнаружено производное аспарагиновой кислоты и уридин-5 -фосфата [306], а в экстрактах из дрожжей (Гоги1ор815 ШШз) отмечено также присутствие аспарагинового, глутаминового, аргининового и аланинового производных уридин-5 -пирофосфата [307]. Из печени и лактирующих млечных желез выделены производные глутаминовой и аспарагиновой кислот и аденозин-5 -пирофосфата [308]. В связи с рассмотрением такого рода соединений интересно отметить, что в пекарских дрожжах обнаружена обусловленная нуклеозид-5 -трифосфатом активация пептидов, которая связана с протеолитическими процессами (поскольку к диализированной неочищенной фракции белка не было добавлено никаких аминокислот или пептидов). На 1 моль образовавшегося (из активированного пептида) гидроксамата приходилось стехио-метрическое количество освобожденного неорганического фосфата. Та же ферментативная фракция катализирует обмен радиоактивного фосфата с каждым из четырех рибонуклеозид-5 -трифосфатов [309]. [c.231]

Клетки Е. oli выращивались на среде, содержащ изотоп серы или углерода С . В некоторый момент клетки переносились на обычную питательную среду без изотопной метки и одповременно с помощью индуктора запускался синтез фермента Р-галактозидазы. Фермент выделялся в чистом виде из суммарного клеточного белка, затем измерялся его изотопной состав. Оказалось, что Р-галактозидаза содержит только нерадиоактивную серу или углерод, т. е. целиком синтезирована из веществ с изотопным составом той среды, на которой клетки жили в данный момент. В то же время все прочие белки клеток построены из аминокислот, меченных радиоактивными изотопами. Если бы распад и ресинтез белков действительно имел место, Р-галакто-зидаза должна была бы синтезироваться с исиользованием радиоактивных иредшественников — пептидов или аминокислот. Ничего подобного не наблюдалось. Синтезированные белки в живых клетках абсолютно не расщеплялись и оставались неизменными, пе вступая в обмен со средой. [c.447]

Результаты Динцеса чрезвычайно ярки. Все несколько десятков пептидов можно было расположить в ряд по настроению относительной радиоактивности (рис. 147). Картина явления находится в полном согласии с рассмотренной выше моделью. За время I успевает синтезироваться отрезок цени I. На матрицах всегда имеются макромолекулы, которые почти завешены и будут закончены за время Однако вовсе не обязательно, чтобы они содержали лейцин. Чтобы добраться до первого лейцина, нужно [c.455]

В последние годы получены важные данные о строении активного центра фермента фосфоглюкомутазы, катализирующего эту реакцию, а также о механизме этой реакции [6 ]. Кристаллическая фосфоглюко-мутаза, меченная при помощи обменной реакции с глюкозо-6-подвергалась частичному кислотному гидролизу. В радиоактивных фракциях пептидов определялась последовательность аминокислот. [c.173]

Для многих исследований можно подобрать такой предшественник, который будет весьма специфичным ддя определенного класса макромолекул (например, лейцин для белка). В таких случаях меченые молекулы можно определить по их радиоактивности в присутствии других немеченых веществ. Однако для изучения различных вопросов метаболизма желательно использовать неспецифический предшественник, который будет включаться в пуклеиновые кислоты, белки и другие клеточные компоненты и метить их. В этом случае необходимо отделять и очищать каждый класс изучаемых молекул. Обзор методов химического фракционирования различных биополимеров приведен в ряде работ [2, 3]. Первая попытка использовать фильтры для улучшения фракционирования была сделана при разделении радиоактивности разных биополимеров после включения в них 1-С -глицина. Однако в этом случае полученные фракции нуклеиновых кислот были загрязнены пептидами, которые требовалось удалять [4]. [c.138]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология