ДНК Полимераза бактериофага

Рис. 2.16. Репликация двухцепочечной ДНК. При деспирализации ДНК возникает промежуточная разветвленная структура (репликативная вилка). Обе одиночные цепи ДНК имеют противоположную полярность (5 -+ 3 и 3 5 ). ДНК-полимеразы способны катализировать синтез только в одном направлении (5 З ). Поэтому синтез одной цепи может происходить непрерывно в направлении продвигающегося раскручивания двойной спирали. Другая же цепь должна синтезироваться в обратном направлении. Синтез начинается с образования короткого отрезка РНК, служащего затравкой (праймером) (у бактериофага Т7 это основания А-С-С-А). Затем ДНК-полимераза осуществляет синтез цепи ДНК длиной в 1000-2000 нуклеотидов, примыкающей к этой РНК. В конце концов РНК-праймер удаляется экзонуклеазой, брешь заполняется ДНК-полимеразой (й) и закрывается ДНК-лигазой (б). Такой механизм дробного , или прерывистого , синтеза ДНК с последующим связыванием отдельных отрезков позволяет объяснить репликацию ДНК на антипараллельной цепи.

Известны также РНК-зависимые РНК-полимеразы, кодируемые геномами РНК-содержащих вирусов и бактериофагов. [c.268]

В качестве примера рассмотрим три системы регулируемой экспрессии рекомбинантных генов в клетках Е. соН, которые получили широкое распространение. В одном случае для контроля экспрессии клонированных генов используют хорошо изученную систему регуляторных элементов лактозного оперона [123], в другом - систему промотор-репрессор-оператор фага [124], в третьем - промоторы и РНК-полимеразы бактериофагов [125]. Принцип регуляции экспрессии рекомбинантных генов в первых двух случаях один и тот же. В векторные молекулы вводятся регуля- [c.108]

Первыми указаниями на то, что в спорулирующих клетках происходят изменения транскрипционной специфичности, послужили данные о том, что некоторые бактериофаги способны инфицировать вегетативные, но не спорулирующие клетки. При этом развитие бактериофагов нарушается из-за неспособности транскрибировать свою ДНК. Мы не можем описать все изменения, происходящие при споруляции не знаем мы и возможных механизмов, принимающих участие в этом процессе, но ряд превращений, происходящих на ранних стадиях (как сейчас стало ясно), связан с изменениями в специфичности инициирования транскрипции РНК-полимеразой. [c.157]

В результате биохимического и генетического изучения белка-репрессора лактозного оперона. репрессора бактериофага лямбда, а также других регуляторных белков у бактерий была сформулирована общая модель регуляции транскрипции у прокариот. Предполагалось, что сайт-специфические белки либо ингибируют, либо стимулируют транскрипцию какого-либо гена, присоединяясь к ДНК рядом с промотором-участком, с которого РНК-полимераза начинает синтез РНК. Считали, что изменение в положении таких регуляторных белков по отношению к ДНК (связывание или отсоединение) включает и выключает гены. [c.183]

Многосубъединичная структура, свойственная прокариотическим и в еще большей мере эукариотическим РНК- юлимеразам, не является обязательным условием для осуществления процесса транскрипции. Известны эффективно работающие РНК-полимеразы, состоящие из одной субъединицы. Такие РНК-полимеразы образуются в клетках бактерий, инфицированных некоторыми вирусами. Из них наиболее изучена РНК-полимераза бактериофага Т7, которая возникает в клетках Е.соН, зараженных фагом, и программа, для синтеза которой содержится в ДНК фага ТТ. [c.184]

Известно два случая, когда выключение экспрессии одних генов и включение других связано с заменой сиг-ма-фактора. Одно из этих явлений-спорообразование, или споруляция-состоит в резких морфологических изменениях, переводящих бактерии в покоящуюся форму (спору), способную переживать неблагоприятные условия. Другое явление обнаруживается при литической инфекции клетки бактериофагом. Когда инфекция развивается по этому пути, то в конце концов в результате размножения фага клетка погибает. Во всех наиболее простых случаях при развитии фага происходит переключение транскрипции. Однако известен только один хорошо изученный случай, когда изменения транскрипционной специфичности обусловлены заменой клеточного сигма-фактора на фаговый. (Это обнаружено в бактериях, способных образовывать споры.) Чаще изменения происходят под действием других механизмов-обычно с использованием дополнительных факторов транскрипции. Создается впечатление, что регуляторный механизм, основанный на возникновении изменений в самой РНК-полимеразе, неохотно используется клеткой, и только в качестве последней возможности. Вероятно, что способность использовать заменяемые друг друга сигма-факторы эволюционно возникла только у очень ограниченного круга бактерий. [c.157]

ДНК-полимераза бактериофага Т4 получается из клеток Е. oli, инфицированных бактериофагом Т4. Фермент обладает ДНК-по-лимеразной и значительно более высокой по сравнению с ДНК-полимеразой I 3 -> 5 -экзонуклеазной активностью, но, в отличие от последней, не проявляет 5 -> З -экзонуклеаэную активность. [c.351]

Первая глава данного тома касается использования плаз-мидных векторов, имеющих в своем составе высокоспецифичные промоторы РНК-полимераз некоторых бактериофагов. Такие векторные молекулы позволяют получать радиоактивно меченные зонды, которые благодаря своим уникальным свойствам все шире применяются сейчас в исследованиях структуры и функций нуклеиновых кислот. Подобные системы на основе космидных векторов рассматриваются во второй главе. Эти векторы разработаны для того, чтобы сделать менее трудоемкими прогулки по хромосомам высших организмов. Фаговые промоторы здесь расположены таким образом, что синтезируемый радиоактивно меченный зонд соответствует концевой области клонированной ДНК, а это облегчает поиск клонов, содержащих перекрывающиеся сегменты ДНК. [c.8]

Инактивация РНК-полимеразы Е. соИ при инфицировании бактериофагом Т4 [c.130]

Существенная деталь схемы, показанной на рис. 15-5, состоит в том, что если пурин находится с левой стороны (как это показано на рисунке), то на правой стороне остается место лишь для пиримидинового кольца. Таким образом, вероятность наличия на правой стороне А и О исключена и остается выбирать только между С и и (или Т). Однако и не подойдет, потому что диполь, необходимый для образования водородной связи, расположен в этом основании в неправильном направлении. В растворе эти биполярные группы гидратированы. Маловероятно, чтобы эти группы отщепляли связанные с ними молекулы воды до образования водородных связей внутри пары оснований. Связыванию будет препятствовать, однако, не только то обстоятельство, что молекулы и (или Т) неспособны образовывать прочные водородные связи внутри свободного участка, показанного на рис. 15-5, но также наличие электростатического отталкивания одноименно заряженных концов диполей. В результате сродство РНК-полимераэы к неправильно спариваемым основаниям окажется сниженным. Снижение сродства (увеличение значения кажущейся КиС) удалось наблюдать в эксперименте, по крайней мере для ДНК-полимеразы бактериофага Т4, для иоторой известны мутантные формы. Одна из них, [c.213]

Пытаясь найти по возможности более простые системы для изучения синтеза ДНК, многие исследователи обратились к мелким ДНК-содержащим вирусам типа ФХ174 и М13. Они не обошли при этом вниманием бактериофаги, снабженные отростками фаги Я, Т7 и Т4, а также плазмиду колицина Е-1. Преимущество этих систем состоит в том, что для них легче смоделировать репликацию ДНК в клеточных экстрактах, а кроме того, ДНК вирусов и плазмид хорошо изучены с генетической точки зрения. Во многих случаях репликация зависит как от генов вируса, так и от генов клетки-хозяина. Так, например, мутации генов dnaB, D, Е, F и О приводят к потере способности поддерживать рост фага X точно так же, как и в случае, когда инактивированы /s-гены. Вместе с тем фаг X сохраняет способность к репликации в бактериях с мутантными генами А я С. Многие вирусы, в том числе Т-четные фаги, содержат гены, кодирующие синтез своих собственных специфических ДНК-полимераз и других белков, необходимых для репликации. [c.276]

Для ответа на данный вопрос кольцевую ДНК этого вируса полностью копировали в присутствии ДНК-полимеразы бактериофага Т4, праймосомы Т4 (комплекс геликазы и РНК-праймазы), различных rNTP (рибонуклеозидтрифосфатов) и dNTP (дезокси-рибонуклеозидтрифосфатов). Затем двухцепочечные кольцевые продукты обрабатывали рестриктазой, которая расщепляет двойную цепь в специфическом участке. Продукты этого расщепления подвергали денатурации, после чего анализировали последовательность нуклеотидов ДНК методом гель-электрофореза с высоким разрешением. Было обнаружено много отдельных полос. Если продукты расщепления до электрофореза обрабатывали РНКазой, то все они становились на пять нуклеотидов короче, о чем свидетельствовала более быстрая миграция их в секвени-рующем геле. [c.25]

С целью разобщить трансляцию и транслокацию вы осуществили клонирование гена в плазмиде рядом с промотором для РНК-полимеразы бактериофага (рис. 8-11). Такое расположение позволяет получить транскрипцию гена in vitro при добавлении [c.113]

Особые РНК-полимеразы обеспечивают транскрипцию клеточных органелл эукариот — хлоропластов и митохондрий. В составе хлоропластной ДНК обнаружены гены, гомологичные генам, кодирующим а-, - и -субъединицы РНК-полимеразы Е. oli. Это, а также сходство нуклеотидной последовательности промоторов бактерий и хлоропластов свидетельствует о том, что РНК-полимераза хлоропластов должна быть сходна с РНК-полимеразой бактерий. РНК-полимеразы митохондрий состоят, по-видимому, всего из одной субъединицы, подобно РНК-полимеразам, кодируемым некоторыми бактериофагами, такими, как ТЗ и Т7. РНК-полимераза митохондрий дрожжей сходна с РНК-полнмеразами этих фагов по аминокислотной последовательности. Ген, кодирующий митохондриальную РНК-полимеразу, располагается в ядре. [c.136]

РНК-полимеразы — это ферменты, осуществляющие транскрипцию генетической информации с цепи ДНК. Поскольку ДНК в клетке состоит из двух цепей, невольно возникает вопрос каким образом на двухцепочечной матрице может образовываться одноцепочечная РНК Частичный ответ на этот вопрос следует из того факта, что очищенные РНК-полимеразы способны также синтезировать РНК из четырех рибонуклеозидтрифосфатов, используя в качестве матрицы одноцепочечную ДНК. Этот факт позволяет предположить, что механизм транскрипции, подобно механизму репликации ДНК, включает в себя спаривание оснований. С этим выводом хорошо согласуется способность РНК-полимеразы превращать одноцепочечную ДНК из бактериофагу ФХ174 (дополнение 4-В) в двуХ1 рчечную гибридную люл улу [c.205]

Для транскрипции с промотора бактериофага Т7 нужна соответствующая РНК-полимераза. Чтобы можно было использовать этот промотор, ген РНК-полимеразы фага Т7 встраивают в хромосому Е. соИ в составе профага X, поместив его под контроль /ас-промотора. Затем клетки трансформируют плазмидой, содержащей ген-мишень под контролем Т7-промотора, и добавляют в среду ИПТГ. В этих условиях происходит индукция гена РНК-полимеразы Т7, синтезируется РНК-полимераза и происходят транскрипция и трансляция клонированного гена. Часто между временем индукции гена РНК-полимеразы Т7 и началом транскрипции гена- [c.108]

Др. разновидносгь Р.б. изменяет каталитич. св-ва РНК-полимеразы (т.наз. белки-антитерминаторы). Так, у бактериофага X известны два таких белка, к-рые модифицируют РНК-полимеразу так, что она не подчиняется клеточным сигналам терминации (окончания) транскрипции (это необходимо для активной экспрессии фаговых генов). [c.218]

Чтобы обеспечить образование непрерывной цепи ДНК из многих таких фрагментов, в действие вступает особая система репарации ДНК, удаляющая РНК-затравку и заменяющая ее на ДНК. У бактерий РНК-затравка удаляется нуклеотид за нуклеотидом благодаря 5 -> З -экзонуклеазной активности ДНК-полимеразы. При этом каждый отщепленный рибонуклеотидный мономер замещается соответствующим дезоксирибонуклеотидом (в качестве затравки используется З -конец синтезированного на старой цепи фрагмента). Завершает весь процесс фермент ДНК-лигаза, катализирующий образование фосфодиэфирной связи между группой З -ОН нового фрагмента ДНК и 5 -фосфатной группой предыдущего фрагмента. Образование этой связи требует затраты энергии, к-рая поставляется в ходе сопряженного гидролиза пирофосфатной связи кофермента-никотинамидадениндинуклеотида (в бактериальных клетках) или АТФ (в животных клетках и у бактериофагов). [c.253]

Одна из наиболее упо фебляемых схем такого мутагенеза приведена на рис. 85. С этой целью исходный ген встраивают в двунитевую репликативную форму ДНК фага М13, зрелые частицы которого содержат однонитевую кольцевую молекулу ДНК (плюс-цепь, см. 5.7). Введение полученной рекомбинантной ДНК в бактериальные клетки приводит к накоплению частиц бактериофага, содержащих однонитевую рекомбинантную ДНК, из которых ее можно выделить и использовать в качестве матрицы для ДНК-полимеразы. Для репликации используют специально сконструированный праймер, который соответствует участку встроенного гена, содержащему кодирующий элемент заменяемой аминокислоты. При этом по обе стороны от этого тринуклеотнда праймер полностью комплементарен рекомбинантной ДНК, а в пределах этого тринуклеотида заменен таким образом, чтобы в образующейся при репликации минус-цепи образовалась запла- [c.305]

Как и репликация, транскрипция состоит из трех основных этапов инициации, элонгации и термииации. В отличие от ДНК-полимераз, РНК-полимеразы способны к самостоятельной инициации синтеза РНК, которая осуществляется в определенных точках ДНК. Место инициации сиитеза РНК определяется специальными регуляторными участками ДНК—промоторами. Тсрмииация синтеза также происходит на специфических участках ДНК —терминаторах. Процесс транскрипции регулируется разнообразными способами, что позволяет клетке приспосабливаться к изменениям условий существования. Наиболее хорошо изучены транскрипция и способы ее регуляции у бактерий и бактериофагов. [c.412]

Потом наступила очередь второго. Когда кишечная палочка заражается бактериофагом Т7, то сначала часть генов фаговой ДНК считывается хозяйской РНК-полимеразой. Но потом появляется совсем другая, фаговая РНК-полимераза, которая начинает считывать остальные, так называемые поздние , гены фаговой ДНК. Так в зараженной клетке происходит процесс перехода власти от законного хозяина, ДНК Е. oli, к вторгшемуся паразиту — фаговой ДНК. Заметим, между прочим, что факт переключения синтеза молекул РНК с ранних на поздние при фаговой инфекции был открыт нашим соотечественником Р. Б. Хесиным и его сотрудниками на рубеже 50-х и 60-х годов. [c.51]

Получены четкие доказательства (см. стр. 161 и 250) того, что репликация РНК вирусов сопровождается образованием дв х-ценочечной репликативной формы РНК. В качестве примера можно назвать репликативную форму РНК, образующуюся нри действии РНК-зависимой РНК-полимеразы (РНК-синтетазы) в клетках Е. oli, инфицированных РНК бактериофага MS2 (стр. 250). Эта РНК устойчива к рибонуклеазе, но нри нагревании до высоких температур (от 102 до 104°) наступают резкие изменения. При быстром охлаждении образуется чувствительное к действию рибонуклеазы вещество устойчивость к рибонуклеазе восстанавливается, если это вещество охладить до температуры ниже ее температуры плавления [79—84, 94]. При градиентном центрифугировании двухцепочечная форма характеризуется несколько меньшей плотностью, чем соответствующая одноценочечная. [c.59]

Открытие ДНК-зависимой РНК-полимеразы совпало во времени с возникновением концепции о существовании информационной РНК, условно обозначаемой т-РНК. В то время как существование РНК-полимеразы было установлено в опытах in vitro с бес-клеточными системами, гипотеза об т-РНК основывалась на результатах изучения in vivo бактериальных клеток, зараженных и незараженных бактериофагом. Информационная РНК представляет собой комплементарную форму РНК (или Д-РНК), образующуюся под влиянием ДНК-зависимой РНК-иолимеразы. Ей посвящены многочисленные обзоры [9, 76—86]. [c.240]

При изучении условий действия полимеразы из зобной железы теленка было показано, что, прежде чем ДНК начинает действовать как затравка, водородные связи между полинуклеотидными цепями разрываются и что в действительности роль затравки могут выполнять только однотяжные цепи или (что, по-видимому, более точно) однотяжные участки. Так, неактивная ДНК-затравка легко превращается в активную затравку при тепловой денатурации. Аналогичным образом одноцепочечная ДНК из бактериофага фХ- 74 [c.322]

Итак, полимераза синтезирует фаговую РНК в пробирке, причем копирование происходит с такой точностью, что новообразованная РНК оказывается инфекционной в той же степени, что и исходная, экстрагированная из клеток Es heri hia oli, точнее из бактериофагов, РНК-мат-рица. [c.397]

Собственно говоря, в опыте Спигелмана все естественное ни РНК, ни полимераза, ни нуклеотиды не были синтезированы в лаборатории все они были получены из живых клеток или из бактериофага Рр. Лишь условия опыта были искусственными , т. е. имитируюш,ими природные условия. Описанная бесклеточная система отличается большой чувствительностью достаточно малейшего изменения концентрации компонентов или появления загрязнений (скажем, примеси рибонуклеазы)— и она перестает работать. Приходится только удивляться, что такую систему удалось собрать вне клетки, что точное копирование генома вообще может происходить в пробирке. Но тот факт, что эта столь лабильная система, за которой необходимо так заботливо следить вне клетки, может функционировать и в клетке, причем несравненно надежнее, граничит с чудом. Ведь в клетке — это означает (помимо всего прочего) в присутствии тысяч промежуточных продуктов обмена и тысяч ферментов (в том числе рибонуклеазы), в присутствии рибосом и РНК, всевозможных ионов и т. д. Почти каждый из этих компонентов в отдельности мог бы разрушить нашу систему в реторте . Напротив, в клетке они, по-видимому, не вредят синтезу, точно так же как, скажем, удвоение генома не нарушает других клеточных процессов. [c.398]

Для мечения очищенных молекул ДНК радиоизотопами широко используются два метода. В первом случае в молекулу ДНК с помощью ДНК-полимеразы I Е oli вводят радиоактивно меченные нуклеотиды (рис. 4-65. А). Нри этом получают радиоактивные ДНК-зонды . используемые в реакциях гибридизации нуклеиновых кислот (см. ниже). Во втором методе фермент полинуклеотидкиназа из бактериофага [c.233]

Более мелкие ДНК-содержащие вирусы, например обезьяний вирус SV40 или мельчайший бактериофаг ФХ174, несут в себе гораздо меньше генетической информации и гораздо больше зависят от ферментов клетки-хозяина как в синтезе своих белков, так и в синтезе своей ДНК. Они подчиняют себе и используют для своих иужд клеточные ферменты, участвующие в репликации ДНК, в том числе и ДНК-полимеразу. [c.316]

Уже давно известно, что многие бактериофаги Е. соЫ кодируют РНК-полимеразы, способные взаимодействовать лишь со специфическими промоторами фаговой ДНК- Фаги Т7 и ТЗ — первые тому примеры [1], а относительно недавно полимераза с подобными свойствами была обнаружена и у фага SP6 Salmonella typhlmurium [2]. [c.12]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология