Методы физической иммобилизации ферментов

Существуют два принципиально различных метода иммобилизации ферментов без возникновения ковалентных связей между ферментом и носителем (физические методы иммобилизации) и с образованием ковалентной связи между ними (химические методы иммобилизации). Каждый из этих методов осуществляется разными способами (рис. 4.4). [c.87]

Физические методы иммобилизации ферментов реализуются посредством адсорбции фермента на нерастворимом носителе, путем включения энзимов в поры поперечносшитого геля, в полупроницаемые структуры или двухфазные системы. [c.88]

Предложено большое число разнообразных методов иммобилизации, основанных как на физической сорбции, так и на ковалентном присоединении белков к носителям. Одним из наиболее полулярных химических приемов является обработка глутаровым альдегидом смеои фермента и полимерного носителя, содержащего аминогруппы. При этом молекулы глутарового альдегида образуют основания Шиффа с аминогруппами белка (в первую очередь е-аминогруппами остатков лизина) и носителя, которые далее могут быть восстановлены до соответствующих аминов [c.159]

Приведенная классификация условна, поскольку не всегда возможно провести четкую границу между различными способами иммобилизации. Например, при иммобилизации путем включения в гель последний можно рассматривать как полупроницаемую мембрану, отделяющую фермент от раствора субстрата. Тем не менее использование такой классификации полезно в том отношении, что она позволяет систематизировать существующие методы физической иммобилизации и помогает ориентироваться в их огромном многообразии. [c.45]

Для иммобилизации фермента используют два метода химическую модификацию фермента введением групп, снижающих его растворимость, и физический захват фермента инертным носителем, например крахмалом или полиакриламидом (гл. 6). Для изготовления электродных датчиков более всего подходит химическая иммобилизация. [c.121]

Иммобилизация представляет собой включение фермента в такую среду, в которой для него доступной оказывается лишь ограниченная часть общего объема. На практике для иммобилизации ферментов используют рутинные физические и химические методы. Все существующие методы физической иммобилизации (т. е. иммобилизации, при которой фермент не соединяется с носителем ковалентными связями) могут быть подразделены на четыре основные группы [c.85]

Согласно одному из принятых определений, которое вытекает из более общего определения иммобилизации, сформулированного во Введении, под иммобилизацией фермента понимается его включение в какую-либо изолированную фазу, которая отделена от фазы свободного раствора, но способна обмениваться с находящимися в последней молекулами субстрата или эффектора. Иными словами, иммобилизация представляет собой включение фермента в такую среду, в которой для него доступной является лишь ограниченная часть общего объема. На основании этого определения все существующие методы физической иммобилизации (т. е. иммобилизации, при которой фермент не соединен с носителем ковалентными связями) можно разделить на четыре группы 1) адсорбция на нерастворимых носителях 2) включение в поры геля 3) пространственное отделение фермента от остального объема реакционной системы с помощью полупроницаемой перегородки (мембраны) 4) включение в двухфазную реакционную среду, где фермент растворим и может находиться только в одной из фаз. [c.45]

При сопоставлении различных приемов иммобилизации химические методы для крупномасштабных процессов кажутся малопривлекательными из-за сложности и дороговизны. Действительно, сегодня нельзя с достоверностью назвать ни одного промышленного процесса с ковалентно иммобилизованными ферментами — обычно в них используются те или иные методы физической иммобилизации. [c.96]

Процессы биотрансформации органических продуктов, занимающие важное место в биотехнологии, успешно реализуются с использованием иммобилизованных бйокатализаторов. Иммобилизованными считают ферменты или клетки микроорганизмов, движение которых в пространстве частично или полностью ограничено. Иммобилизация представляет большой практический интерес, поскольку позволяет обеспечить легкое отделение биокатализатора от реакционной среды, способствует повьппе-нию устойчивости и увеличению времени его активной работы. На практике для этой цели применяются два основных метода включение биокатализатора в ограниченное пространство геля или капсулы либо его ковалентное связывание или физическая сорбция на инертных адсорбентах. [c.124]

Все известные методы иммобилизации принято разделять на физические и химические. Из методов первой группы наиболее щироко применяются адсорбция на нерастворимых носителях и включение в структуру геля. Они особенно эффективны при разработке новых перевязочных материалов, мазей и кремов различной направленности действия. Метод иммобилизации ферментов в полупроницаемые оболочки часто называют методом микрокапсулирования, механизм которого заключается в фиксировании водных растворов ферментов в замкнутых сферических коацерватах, имеющих тонкую полимерную оболочку, способную удерживать изнутри высокомолекулярный субстрат и в то же время дающую возможность свободно диффундировать через нее низкомолекулярному. Это позволяет сохранить фермент одновременно в нативном и в иммобилизованном состоянии, многократно вводить и выводить его из реакционной смеси [34, 35]. Представляет интерес метод включения ферментов в липосомы, которые имеют большие возможности применения в медицине, так как по своему составу приближаются к клеточным мембранам [36]. [c.206]

Если индикаторная реакция катализируется ферментами, то такие электрохимические системы называют ферментными электродами. По номенклатуре ИЮЕ[АК ферментный электрод определяется как датчик в котором ионоселективный электрод покрыт слоем, содержащим фермент, вызывающий реакцию органического или неорганического вещества (субстрата) с образованием веществ (ионов, молекул), обусловливающих отклик электрода . В настоящее время понятие ферментный электрод несколько расширилось, так как в него включают электрохимические системы с ферментом, закрепленным не только на чувствительном элементе ионоселективного электрода, но и на носителе, расположенном на некотором расстоянии от него или даже в растворе. В первых ферментных электродах ферменты физически удерживались на поверхности электрода или в непосредственной близости от него. Позже были предложены методы химической иммобилизации, осаждения и др. [c.213]

Другие приемы иммобилизации ферментов, основанные на физических методах, менее распространены по сравнению с рассмотренными выше. [c.90]

В настоящее время разработано большое число методов иммобилизации, многие из которых повторяют приемы иммобилизации ферментов. В определенной мере выбор методики определяется желаемым физиологическим состоянием клеток и целью, с которой они применяются. На рис. 5.1 представлены типы физиологического состояния иммобилизованных клеток. Понятно, что некоторые методы не подходят для всего спектра состояний, другие же практически в равной степени пригодны для иммобилизации клеток в любом физиологическом состоянии. Методы иммобилизации можно разделить на группы согласно используемому физическому процессу прикрепление, внедрение, включение и агрегация. [c.169]

Рассматривая ферменты как специфические химические преобразователи, переводящие определяемое вещество в форму, детектируемую физическими или химическими методами, удалось придумать и разработать новый класс сенсоров, для которых характерна чувствительность к биологическим соединениям. Перспективным путем повышения селективности и чувствительности и расширения возможностей этих устройств является комбинирование различных ферментов, например эстераз, дегидрогеназ и оксидаз с детекторами-полярографическими, кондуктометрическими, потенциометрическими, акустическими и оптическими. Б первых ферментных электродах ферменты физически удерживались на поверхности сенсора или в непосредственной близости от нее. Позже были предложены методы химической иммобилизации, осаждения и другие. Коферменты также физически или химически закрепляются на поверхности сенсора. Перевод фермента в нерастворимую форму как способ увеличения его времени жизни позволяют избежать осложнений, связанных с осмотическими явлениями в коллоидных растворах, особенно когда в ферментном электроде используется проницаемая для определяемого компонента мембрана В идеальном случае ферментный биосенсор должен работать непосредственно в неразбавленной цельной крови, подобно газовым и рН-электродам, в свое время произведшим революцию в анализе. [c.11]

Поскольку микроорганизмы и бактерии чз ствительны к изменениям окружающей среды, для их иммобилизации используют преимущественно мягкие методы, такие как включение в гель или физическую адсорбцию. Обычно применяют акриламидные гели, желатин, коллаген, латекс натурального каучука, эфиры целлюлозы. Проблема селективности решается подбором соответствующей питательной среды, в которой действие других ферментов подавляется, а также выбором оптимальных условий регистрации [c.505]

Вопрос о том, произошли ли в белке конформационные изменения при иммобилизации, решается исследованием структуры иммобилизованных ферментов физическими методами. Для этой цели с успехом использовали оптические методы (спектрофотометрический, флуоресцентный), метод спиновых меток и др. Анализируя данные этих исследований, можно сделать следующие выводы. [c.98]

В отличие от физических методов этот способ иммобилизации обеспечивает прочную и необратимую связь фермента с носителем и часто сопровождается стабилизацией молекулы энзима. Однако расположение фермента относительно носителя на расстоянии одной ковалентной связи создает стерические трудности в осуществлении каталитического процесса. Фермент отделяют от носителя с помохцью вставки (сшивка, спейсер), в роли которой чаще всего выступают бифункциональные и полифункциональ-ные агенты (бромциан, гидразин, сульфурилхлорид, глутаровый диальдегид и др.). Например, для выведения галактозилтрансфе-разы из микроокружения носителя между ним и ферментом вставляют последовательность — СНг—КН—(СНз)5—СО—. В этом случае структура иммобилизованного фермента включает носитель, вставку и фермент, соединенные между собой ковалентными связями (рис. 4.5). [c.91]

Очень перспективным методом очистки воды от всевозможных загрязняющих ее веществ, особенно синтетических, является использование иммобилизованных (закрепленных, нерастворимых) ферментов — ферментов второго поколения . Идея закрепления ферментов на нерастворимом в воде носителе и применения таких мощных катализаторов в технологических процессах и медицине возникла давно. Еще в 1916 г. осуществлена адсорбция инвертазы на активированном угле в свежевыделенной гидроокиси алюминия. С 1951 г. для фракционирования антител и выделения антигенов используют конъюгацию белков с целлюлозой. До недавнего времени существовал единственный метод закрепления ферментов — обыкновенная физическая адсорбция. Однако адсорбционная емкость известных материалов относительно белков явно недостаточна, а силы адгезии невелики, и разрыв связи между ферментом и поверхностью адсорбента может наступать от малейших изменений условий процесса. Поэтому такой метод иммобилизации не нашел широкого применения, но, поскольку он прост и может, по-видимому, способствовать выяснению механизма действия ферментов в живых системах, илах и почве, а в некоторых случаях применяться на практике, некоторые исследователи занимаются изучением адсорбции ферментов, поиском новых, эффективных носителей и т. д. [104, 206]. [c.176]

Аффинная хроматография основана на использовании равновесного состояния высокоспецифического связывания, встречающегося в биологических системах. Этот метод позволяет осуществлять такое разделение веществ, которое невозможно достичь с помощью других способов [19, 20, 22]. Суть метода заключается просто в иммобилизации одного из компонентов обратимо связывающейся системы на твердом носителе и последующем его взаимодействии с другим компонентом (компонентами) этой равновесной системы, приводящем к отделению сопутствующих примесей. Таким образом, разделение основано на специфическом связывании компонентов данной системы, а не на различиях в их физических и химических свойствах. Методы аффинной хроматографии хорошо разработаны. Они используются для разделения и очистки компонентов таких высокоспецифически связывающихся комплексов, как антиген— антитело, гормон—связывающий белок, фермент— лиганд. Основными факторами, определяющими процесс разделения, являются природа и химическая струк- [c.216]

В идеале поверхность иммунореактивной индикаторной полоски должна быть однородной, не склонной к неспецифическим взаимодействиям и пригодной для контролируемой иммобилизации различных веществ с помощью удобных методов. В качестве матрицы для ковалентной иммобилизации реагентов мы выбрали листы хроматографической целлюлозы, так как они обладают подходящими химическими и физическими характеристиками. Целлюлоза гидрофильна, достаточно однородна, ей несвойственно неспецифическое связывание. Кроме того, она доступна в виде листов разной толщины и плотности. На целлюлозе с помощью целого ряда хорошо отработанных методов (Lilly, 1976) можно иммобилизовать большие количества ферментов и антител. Это позволяет получать индикаторные полоски, обладающие высокой стабильностью и иммунологической активностью. [c.132]