Белки, гель-фильтрация с целлюлозой

Еще одна особенность хроматографии макромолекул связана с проблемой доступности всего объема неподвижной фазы внутри гранул. Ограничение такой доступности вследствие статистического разброса размеров пор пространственной сеткн гранул используется для фракционирования макромолекул по размерам в методе гель-фильтрации, одиако в других вариантах хроматографии ограничение доступности не только уменьшает емкость системы, но и существенно затрудняет установление равновесия в неподвижной фазе. В этом плане обычные микропористые обменники на основе силикагеля, стекла п полистирола существенно уступают крупнопористым матрицам из целлюлозы и даже декстрана. К сожалению, матрицы двух последних типов легко деформируются и потому непригодны для хроматографии при повышенном давлении. Правда, в последние годы путем специальной обработки удалось получить крупнопористые, пригодные для фракционирования белков матрицы и из перечисленных выше жестких материалов их марки и характеристики приведены ниже. [c.47]

Что касается самого процесса ТСХ, то здесь можно усмотреть далеко идущую аналогию с жидкостной хроматографией на колонках. Неподвижную фазу образует н идкость, связанная со слоем фиксированного на подложке гранулированного сорбента, свойства и характеристики которого близки, а иногда даже идентичны таковым для материалов, используемых в качестве носителей неподвижной фазы в колоночной хроматографии. Здесь используются те же производные целлюлозы или силикагеля, к которым надо добавить только полоски ацетилцеллюлозы. Подвижную фазу образует жидкий элюент с аналогичными, рассмотренным ранее свойствами. Неизменной остается и сущность хроматографического процесса, базирующегося на равновесном распределении вещества между неподвижной и подвижной фазами. Как и в любом хроматографическом процессе (гель-фильтрация в тонком слое была рассмотрена в гл. 4), для целей хроматографического фракционирования это распределение должно быть сильно сдвинуто в пользу неподвижной фазы. Из всех вариантов хроматографпп для разделения компонентов белков и нуклеиновых кислот методом ТСХ (сами биополимеры очень редко выступают здесь в качестве объектов) практически пспользуют только два нормальнофазовую распределительную и ионообменную. [c.458]

Для бобовых многие авторы предпочитают использовать ионообменную хроматографию (DEAE — целлюлоза, DEAE — сефадекс и др.) гель-фильтрации. Этот метод в целом обеспечивает достаточное разрешение и использовался для фракционирования белков сои [20,60, 116], гороха [40,47] и люпина [34]. [c.154]

Экстракцией 6%-ным раствором гидроксида калия из измельченных стеблей сильфии 49] выделен белково-полисахаридный комплекс, не разделяющийся в условиях гель-фильтрации и электрофореза. Оп содержал 71 %i полисахарида и более 20% белка. Для оценки взаимосвязи между полисахаридом и белком комплекс фракционировали на ДЭАЭ-целлюлозе и сефадексах G-100 и G-200. В отдельных пробах определяли содержание белка и углеводов. Белковая составляющая не отделялась от полисахаридной, но максимумы их не совпадали, что свидетельствует об отсутствии прочной химической связи между этими полимерами. Аналогичные результаты были получены при попытке расфракциониро-вать этот комплекс методом электрофореза. Количественная ха- [c.117]

Гель фильтрация в тонком слое применяется преимущественно при исследовании белков и гораздо реже в других областях биохимии. Гроссман и Вагнер [23] использовали тонкослойную гель-фильтрацию на сефадексе 0-25 для идентификации компонентов нитросинего тетразолийхлорида, применяющегося обычно для гистохимических целей. Стикланд [24] тонкослойной хроматографией на дауэксе-1 и сефадексе 0-25 удалял из образцов полисахариды и флуоресцирующие примеси, которые обычно интерферируют при фракционировании 5-рибонуклеотидов в тонком слое ОЕАЕ-целлюлозы. Возможность разделения низкомолекулярных соединений в тонком слое сефадекса 0-10 и 0-15 вообще почти не исследовалась. Зюдвиг и сотр. [68] показали, что разделение различных антибиотиков на сефадексе 0-15 зависит от их адсорбции на геле. Не сделано никаких попыток использовать в тонкослойной хроматографии менее гидрофильные гели, например сефадекс ЬН-20. [c.263]

Схема разделения и очистки пептидов, описываемая ниже (включающая гельфильтрацию, хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе или дауэксе-50, высоковольтный электрофорез и хроматографию на бумаге), применима к белкам средней молекуляр-1ЮЙ массы (до 40 000). Крупные фрагмеггты, плохо разделяющиеся на бумаге и элюирующиеся с нее, первоначально отделяют гель-фильтрацией, а основную часть пептидов после фракцио- шрования на ионообменнике очищают окончательно хроматографией на бумаге. Однако эта схема применима далеко ие ко всем типам гидролизатов белков. Например, мембран11ые белки плохо расщепляются ферментами с высокой специфичностью, такими, как трипсин или стафилококковая протеаза гидрофобные пептиды склонны к образованию агрегатов при гель-фильтрации, осаждаются на ионообменных колонках и экстрагируются в охлаждающую среду при высоковольтном электрофорезе на бумаге и в органическую фазу при промывках в реакции Эдмана. Оптимальная схема анализа структуры мембранных белков включает их фрагментацию с помощью химических методов на небольшое число крупных пептидов, разделение в денатурирующих условиях на полиакриламидных гелях и определение аминокислотной последовательности автоматическим методом после присоединения пептида к твердой матрице. Альтернативный вариант основан на использовании протеаз с низкой специфичностью (таких, как пепсин или эластаза). При этом образуется значительное число коротких пептидов, которые [c.352]

Ионообменная хроматография и гель-фильтрация. Эти методы получили в настоящее время наибольщее распространение. Для ионообменной хроматографии, как правило, используют диэтиламиноэтилцеллюлозу (ДЭАЭ-целлюлоза) или ДЭЛЭ-сефадекс. Ионообмеини-ки уравновешивают буферными растворами низкой ионной силы (0,005—0,02 моль) при pH 7,2—8,2 с целью выделения IgG. В указанных условиях наименее заряженная часть молекул IgG не фиксируется на ионообменни-ке, в то время как другие иммуноглобулины и сывороточные белки связаны. Фракционирование можно проводить методом колоночной хроматографии или в объеме. С целью экономии ионообменника для очистки IgG целесообразно выделить первоначально из сыворотки общую глобулиновую фракцию осаждением сульфатом аммония при 50%-ном насыщении. [c.240]

Наносят материал на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой объемом 50 мл (например, Whatman DE-52) в том же буфере и собирают несвязавшуюся фракцию. Она должна содержать около 180 мг белка, представляющего собой в основном IgG. Препарат можно подвергнуть дальнейшей очистке с помощью гель-фильтрации на колонке с сефакрилом S300 в буфере трис/150 мМ Na l. [c.169]

Большое преимущество этого метода — высокий выход антител в целом или отдельных иммуноглобулинов при фракционировании сывороток и возможность разделения двух или более видов антител, относящихся к одному классу Ig, но имеющих различную электрофоретическую подвижность. Кроме того, можно одновременно проводить электрофоретическое разделение нескольких образцов (Braun, Krause, 1968 Johansson, 1972). Однако в отличие от ранее упоминавшихся методов (хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе, гель-фильтрации) количество наносимого на гель материала здесь очень ограничено кроме того, эксперимент занимает много времени, но это окупается простотой отделения иммуноглобулинов от других белков и хорошей воспроизводимостью. [c.63]

Следует подчеркнуть, что большинство препаратов иммуноглобулина определенного класса обычно содержит примеси Ig других классов, за исключением IgG, выделенных хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе, и IgM, выходящих в первом пике при хроматографии на сефадексе G-200. Поэтому рекомендуется проводить рехроматографию полученных препаратов на той же колонке и в тех же условиях, либо использовать какую-то иную процедуру, например электрофорез в агарозном блоке или гель-фильтрацию. Для той же цели можно применить и аффинную хроматографию на сефарозе с класс-специфической антисывороткой. Миеломные белки классов G, А и М и парапротеины при макроглобулинемии Вальденстрёма удается очистить одноэтапной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе или зональным электрофорезом, поскольку они являются основным компонентом сыворотки. Чистоту каждой фракции иммуноглобулинов исследуют с помощью иммуноэлектрофореза, двойной иммунодиффузии или радиоиммунным методом с класс- или подкласс-специфическими антисывороткамн. Чистые белки хранят при 4°С в присутствии 0,02% NaNs или замораживают растворы с концентрацией 10— 30 мг/мл. [c.72]

Присутствие в среде аминов, содержащих динитрофенильную группу [Матяш и др., 1972], не сказывается на степени инактивации пероксидазы при ее обработке 0,1 М раствором EDP-карбо-диимида. Связывание DPD-диамина с пероксидазой наблюдается лищь при его значительном избытке (300 моль/моль белка). После отделения реагентов гель-фильтрацией на сефадексе G-25 модифицированный препарат по спектрофотометрическим данным содержит около 1,3 динитрофенильных остатков на молекулу белка, из которых примерно половина может быть отделена последующей хроматографией на СМ-целлюлозе или же повторной гель-фильтрацией после 3-часовой инкубации в 1 М ацетатном буфере (pH 5). Таким образом, есть основания полагать, что EDP-карбодиимид наряду с ковалентным связыванием DPD-диамина вызывает и его сорбцию белком. Аналогичные результаты получены при использовании DPP-диамина и особенно DPD-диамина (табл. 11). Эффект сорбции, по-видимому, обусловлен разрыхлением белко- [c.108]

Количество белка, которое может связать ионообменник в расчете на единицу объема, может быть очень большим. Однако у обменников классического типа, таких, как материалы на основе целлюлозы, это количество зависит в основном от размеров белковых молекул — чем мельче молекулы белка, тем в большей степени он адсорбируется. При выражении количества белка в молях это различие еш,е увеличивается, Heкoтqpыe типичные величины даны в табл, 4.3. Молекулы белков с мол. массой более 10 не задерживаются (исключаются) большинст вом целлюлозных ионообменников. Здесь проявляется практически тот же ситовой эффект, что и при гель-фильтрации (разд. 5,1). Крупные молекулы могут присоединяться только к поверхности частиц ионообменника, и поэтому емкость ионообменника для них очень низка. Общая емкость связана с вели- [c.105]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология