Разделение компонентов белковых

При определении молекулярной массы биополимеров (белков, нуклеиновых кислот и др.) необходимо учитывать взаимодействие их макромолекул между собой и связанное с ним образование ассоциатов, изомеров и комплексов. Для этой цели удобно использовать такие методы анализа, как седиментация, электрофорез и хроматография. С их помощью можно добиться некоторого разделения компонентов белкового раствора и распределения их в соответствии с определенным законом, который может быть строго описан математически. Сравнивая затем экспериментальное и теоретическое распределения, можно определить параметры, характеризующие взаимодействие макромолекул, восстановить распределение каждого компонента и, наконец, найти по ним молекулярную массу неассоциированных молекул, т. е. мономеров белка. [c.168]

Рис. 37. Электрофоретический сосуд Тизелиуса для количественного изучения подвижной границы и разделения компонентов белков

Реакции осаждения белков используются в клинических и аналитических лабораториях для идентификации и разделения компонентов белка. Эти реакции применяют также для приготовления свободных от белков фильтратов, что необходимо для определения небелковых компонентов крови. [c.323]

На рис. 140 схематически показана граница (полоса) чистого белка, а также границы (полосы), полученные в результате разделения компонентов белковой смеси в электрофоретической кювете. В левой кювете видна един- [c.353]

Так, например, достигнуты большие успехи в извлечении растительных белков. Этому предшествовали в первую очередь работы по экстрагированию липидов (масла и жиры), а также извлечению углеводов (сахара и крахмалы). Сохраняет актуальность и процесс разделения компонентов сельскохозяйственного сырья для их более рационального использования в пищевой промышленности в форме изолятов, самих по себе функционально привлекательных, включаемых в состав различных смесей. [c.6]

Вопросу анализа аминокислот методом хроматографии на бумаге посвящено большое число работ советских и иностранных авторов. Однако почти все они связаны с разделением аминокислот белков и других биологических препаратов [61. Наша попытка применить их для анализа мелассы не дала положительных результатов, что можно объяснить мешающим действием остальных компонентов мелассы, ио отношению к которым содержание отдельных аминокислот составляет лишь 0,1—3 вес. %. Описанный в литературе метод 17, 81, состоящий в сорбции аминокислот на катионите с последующей их элюцией и идентификацией на бумаге неудобен, так как требует сложной специальной аппаратуры и чрезмерно длителен. Первой частью нашего исследования было хроматографическое разделение искусственной смеси из десяти аминокислот, приблизительно имитирующей аминокислотный состав мелассы [1, 81. Смесь включала лизин, аргинин, серии, глицин, аспарагиновую и глютаминовую кислоты, а-аланин, валин, метионин и лейцин. Растворы аминокислот готовили в 15%-ном этиловом спирте с концентрацией 0,5—1 у аминокислоты в 1 мкл. [c.212]

Для распознавания белковых компонентов, присутствующих в изучаемых продуктах, а также для приготовления экстрактов некоторых из этих белков, предназначенных для изучения их свойств, часто бывает необходимо уметь выделять эти биологические вещества. Многочисленный методы выделения, применяемые в лабораториях и в промышленном производстве, можно систематизировать в соответствии с физико-химическими явлениями, на которых они основаны. Итак, можно рассмотреть эти методы в зависимости от разделения компонентов по их растворимости избирательной полной дифференциальной (отдельные варианты распределительной хроматографии) [c.72]

Выделение из мембран индивидуальных компонентов производится с помощью детергентов (например, додецилсульфата натрия), солюбилизирующих нерастворимые вещества, и разделения полученных белков путем электрофореза в полиакриламидном геле. [c.334]

Принцип метода. После электрофоретического разделения исследуемого белка в агаровом геле компоненты специфической иммунной сыворотки диффундируют навстречу полученным фракциям через слой агарового геля, содержащий известные (контрольные) антигены, которые абсорбируют соответствующие антитела и. задерживают их дальнейшую миграцию к определяемым антигенам. В результате в образовании полос преципитации принимают участие только те антигены исследуемого образца, которые отличаются от контрольных. [c.150]

Электрокинетические явления имеют разнообразные практические применения электрофорез — для создания тонких слоев произвольного состава на проводя-ших субстратах, для разделения смеси белков на отдельные компоненты, для введения лекарственных препаратов через кожу пациента электроосмос — для прецизионного дозирования жидкостей и создания микроманипуляторов потенциалы оседания (движения) и протекания — как сигналы разнообразных датчиков. [c.617]

Анализ с помощью метода изотопного разбавления позволяет избежать полного количественного разделения компонентов смеси. Исследуемый белок подвергают гидролизу, после чего в полученный раствор добавляют известное количество одной из аминокислот, предварительно меченной радиоактивным углеродом. (Заметим, что в данном случае молекулы не обязательно должны содержать метку в строго определенном положении). В растворе меченая аминокислота равномерно смешивается с аналогичной немеченой кислотой белка, после чего проводится частичное выделение из раствора исследуемой аминокислоты. Определив активность и массу выделенной порции аминокислоты по формуле (6.13), рассчитывают содержание данной аминокислоты в белке. [c.313]

Оценка чистоты. — Шведские химики Сведберг и Тизелиус внесли большой вклад в развитие химии белка разработкой аналитических методов, чрезвычайно удобных для характеристики этих, высокомолекулярных соединений. Метод ультрацентрифугирования Сведберга служит для определения молекулярного веса. При вращении с очень большой скоростью ячейки, содержащей раствор белка, молекулы белка под действием центробежных сил движутся от центра со-скоростью, зависящей от величины молекулярного веса. Специальная оптическая система дает возможность наблюдать и фотографировать ячейку во время центрифугирования. Молекулярный вес может быть, найден либо из определения седиментационного равновесия, либо по-скорости седиментации- Хотя теоретически первый метод точнее, для достижения равновесия требуется длительное время, и поэтому более точные значения получают, исходя из определения скорости седиментации. При применении ультрацентрифуги можно установить также гомогенность молекул (по величине и форме). Тизелиус предложил (1937) электрофоретический метод разделения молекул белка в электрическом поле молекула белка движется со скоростью, определяющейся величиной молекулы, ее формой, количеством и типом ионизированных групп. Материал, кажущийся гомогенным по растворимости, может содержать компоненты, отличающиеся по электрофоретической подвижности. Жестким критерием чистоты является профиль кривой распределения, получаемой при противоточном распределении молекул (Крейг, см. 31.29). [c.674]

Наконец, следует указать, что электрофорез легко применим для физического разделения компонентов смеси белков. Методики,, используемые для этой цели, описаны в монографии Байера . [c.492]

В отличие от гетерогенных процессов фракционирование смеси вещества в однофазной системе основывается не на перераспределении веществ при установлении равновесия, а на кинетике перемещения компонентов в силовом поле (электрическом, гравитационном) или при наличии градиента концентрации. На этих принципах основаны методы электрофореза, седиментации и диффузии. Если рассматривать сочетание аналитического и препаративного фракционирования, то наибольшее внимание следует уделить электрофорезу. Сложные смеси веществ могут быть с успехом разделены на основе использования этого метода. Во многих случаях он является равноценным по сравнению с лучшими вариантами хроматографии, а для некоторых систем даже превосходит хроматографические методы по эффективности. Особенно важным оказалось использование электрофореза при фракционировании смесей белков и нуклеиновых кислот в колонке, заполненной гелями как природных, так и синтетических полимеров. Степень разделения зон веществ при фракционировании методом электрофореза определяется отношением подвижностей компонентов в электрическом поле. Увеличение высоты колонки здесь также приводит к лучшему разделению компонентов, как и при хроматографии, хотя при электрофорезе нет многократного повторения элементарных актов межфазного переноса. [c.9]

Однако возможна и такая ситуация, когда спектры, а также и профили элюирования очень схожи (вариант близкородственных, плохо разрешенных компонентов). На рис. 5.38 показан результат приложения метода АОК к кластеру из трех пиков, полученных методом жидкостной хроматографии с использованием УФ-детектора. Задача заключалась в разделении трех белков с очень похожими спектрами. Полученная хроматограмма представлена на рис. 5.38, а. Три спектра индивидуальных комнонентов, полученные методом АОК, показаны на рис. [c.302]

На полоску САМ толщиной 0,2—0,5 мм и шириной 2,5 см обычно наносят 0,2—1,0 мкл образца. Для стандартного разделения компонентов сыворотки с последующим фотометрическим определением используется до 3 мкл образца, содержащего 0,1—0,2 мг белка. Оптимальное количество образца зависит от метода обнаружения. Для колориметрического обнаружения после элюирования необходимо наибольшее количество образца, а для фотометрического и радиоизотопного обнаружения — наименьшее. Если проводится фотометрическое обнаружение, наименьшее количество образца требуется в тех случаях, когда [c.295]

Применение ионообменной хроматографии оказалось успешным для таких важных сравнительно низкомолекулярных белков, как лизоцим [123], )ибонуклеаза [60], цитохром С [83, 96], химотрипсиноген [61], инсулин 14] и папаин [73]. В каждом случае разделение производили на смоле R -50 в карбоксильной форме. Разделение смеси белков яичного белка на три компонента было произведено с помощью фронтального анализа на смоле дауэкс-50 [115, 116]. Одновременный электрофоретический анализ исходной альбуминовой фракции подтвердил присутствие трех основных компонентов. Бордман и Партридж [11—13] распространили ионообменную методику на разделение таких больших молекул, как СО-гемоглобин быка и СО-гемоглобин плода овцы. Денатурация была доведена до минимума тем, что работу проводили вблизи 0°. [c.331]

Обзор текущей литературы по биохимии показывает, что в настоящее время методы электрофореза в полиакриламидном геле используются очень широко. Главной областью их применения является разделение смесей белков [54—59] и компонентов РНК [60—63]. Этот метод можно использовать и при изучении особенностей реакций нуклеиновых кислот или полипептидов [64]. [c.153]

Особое распространение получили методы, основанные на использовании антигенов и антител, меченных ферментами, — так называемый иммунофермеитный анализ. Они используются для изучения широкого круга соединений — антител, пептидных и стероидных гормонов, вирусных и бактериальных антигенов, различных белков и ферментов. Существуют гетерогенные (твердофазные) и гомогенные методы иммуноферментного анализа, принципиально различающиеся способом разделения компонентов иммунохимической реакции. Твердофазные методы основаны на применении антител или антигенов, иммобилизованных на нерастворимых носителях. [c.306]

Схема опыта следующая (рис. 47). Из агара отливается пластинка 4—5 мм толщиной и 5 см шириной. В нее в центре вводится раствор разделяемых белков (в точке А) с примесью агара. В итоге получается сплошная пластинка. К ее концам прикладывается электрическое поле с напряжением 4 . В результате происходит электрофоретическое разделение смеси белков на зоны Б, В, Г. При желании эти зоны могут быть проявлены с помощью красителей. Как говорилось выше, нормальную сыворотку лошади удается разделить на 5—9 компонентов (в зависимости от достоинств буфера). Полосы различных белков располагаются по обе стороны от нанесенного пятна А, так как на электрофоретическое перемещение белков накладывается общий поток жидкости вследствие эндосмоса. Через 4—5 часов полосы [c.135]

Тонкослойный электрофорез можно применять и в двумерном варианте разделения. Можно, например, проводить разделение на гелях с различной концентрацией [364]. В этом случае на пластинку либо сразу наносят слои геля с разной концентрацией, либо по окончании разделения в одном направлении вырезают полоску геля, содержащую исследуемые компоненты, и вводят ее в слой с другой концентрацией геля [365, 366]. Возможны также и другие комбинации, например разделение на агаре в одном направлении и на крахмальном геле в другом [367]. При разделении рибосомных белков проводили электрофорез в одном направлении в щелочном буферном растворе, а в другом направлении в кислотном буферном растворе [368, 369]. Для разделения белков пригоден также двумерный иммуноэлектрофорез [370, 371]. В этом случае второе разделение проводят на геле, содержащем антисыворотку. [c.170]

Что касается самого процесса ТСХ, то здесь можно усмотреть далеко идущую аналогию с жидкостной хроматографией на колонках. Неподвижную фазу образует н идкость, связанная со слоем фиксированного на подложке гранулированного сорбента, свойства и характеристики которого близки, а иногда даже идентичны таковым для материалов, используемых в качестве носителей неподвижной фазы в колоночной хроматографии. Здесь используются те же производные целлюлозы или силикагеля, к которым надо добавить только полоски ацетилцеллюлозы. Подвижную фазу образует жидкий элюент с аналогичными, рассмотренным ранее свойствами. Неизменной остается и сущность хроматографического процесса, базирующегося на равновесном распределении вещества между неподвижной и подвижной фазами. Как и в любом хроматографическом процессе (гель-фильтрация в тонком слое была рассмотрена в гл. 4), для целей хроматографического фракционирования это распределение должно быть сильно сдвинуто в пользу неподвижной фазы. Из всех вариантов хроматографпп для разделения компонентов белков и нуклеиновых кислот методом ТСХ (сами биополимеры очень редко выступают здесь в качестве объектов) практически пспользуют только два нормальнофазовую распределительную и ионообменную. [c.458]

Несложная модификация устройства фирмы Desaga позволяет наносить на пластинки линейно изменяющуюся в одном направлении по своим пропорциям смесь двух сорбентов или импрегнировать сорбент линейно возрастающей концентрацией какой-либо добавки ( Gradient TLG-spreader ). ТСХ нескольких идентичных препаратов в направлении, перпендикулярном к градиенту, позволяет выбрать оптимальную пропорцию смеси, а хроматография вдоль градиента открывает возможность разделения компонентов, сильно различающихся по своей подвижности (подобно тому как это происходит при электрофорезе в градиенте пористости ПААГ). Эти возможности, насколько нам известно, еще не использовались для фракционирования компонентов белков и НК, однако целесообразно иметь их в виду. [c.467]

Хро.матографические Ж. а. Действие их основано на разл. сорбционной способности компонентов, входящих в состав анализируемой жидкости. Последняя фракционируется в зтих приборах, и затем разделенные компоненты детектируются посредством оптич., электро- и термохйм. и др. методов. Области применения анализ белков, антибиотиков, витаминов, углеводородов, спиртов, нуклеиновых к-т, нефти определение содержания металлов в жидких средах, бензола и толуола в сточных водах и т. д. (см. также, напр.. Жидкостная хроматография, Тонкослойная хроматография, Эксклюзионная хроматография). [c.151]

При изотахофорезе (iso — равный, ta ho — скорость) [47, 48], также обладающем высокой разрешающей способностью, разделяемую белковую смесь вводят в специальный электролит, содержащий ионы с более высокой подвижностью (лидирующие) и ионы с меньшей подвижностью (терминирующие), чем подвижность ионов белка при равных скоростях перемещения. При добавлении специфических промежуточных ионов, поддерживающих интервал , разделяются белки с очень близкими подвижностями. Препаративное разделение белков проводят большей частью в колонках с полиакриламидным гелем при применении амфолитов в качестве буферных и поддерживающих интервал веществ, причем разделенные компонент- элюируются из колонки с помощью подходящей системы. [c.351]

В последние годы большая потребность в новых методах разделения способствовала появлению целого потока сообш,енип о поведении белков, пептидов и аминокислот при электрофорезе в стабилизирующих средах. При разделениях методом подвижной границы получают лишь частичное разделение компонентов при этом приходится применять меры против конвекции, чтобы стабилизировать границы и облегчить последующее разделение обнаруженных компонентов. В течение ряда лет внимание исследователей было приковано главным образом к разделению белков методом электрофореза на бумаге. Этот метод может дать ценные сведения там, где необходимо провести быстрый предварительный анализ смеси белков. Для препаративных целей и для тонких аналитических разделений данный метод применяется очень редко он почти полностью вытеснен методами электрофореза, в которых используются другие инертные материалы. [c.244]

Хроматографические методы, в которых разделение компонентов смеси основано на различии в размерах, форме или суммарном заряде молекул, часто недостаточно эффективны для разделения смесей белков. В таких случаях может оказаться полезной аффинная хроматография [48]. Успех метода зависит от того, удастся ли найти вещество, которое будет специфически взаимодействовать с подлежащим очистке белком. Для фермента таким веществом может быть конкурентный ингибитор катализируемой этим ферментом реакции, а для участвующего в гормональной регуляции белка-рецептора — соответствующий гормон. Это вещество связывают с подходящим нерастворимым гидрофильным носителем, и полученный материал используют при хроматографии как стационарную фазу. Вещества такого типа часто сами оказываются большими природными макромолекулами, и приемы, используемые для соединения их с носителями, сходны с методами приготовления иммобилизованных ферментов [см. разд. 27.4.2 (5)]. Реакции, с помощью которых белки, содержащие аминогруппы или фенольные группировки, могут быть связаны с носителем на основе сшитого полиакриламида, содержащего некоторое число гидразидных или 4-аминоанилидных остатков (схемы 30, 31 Б — остаток белка). Хорошие результаты получены в тех случаях, [c.322]

Аффинный электрофорез в полиакриламидном геле — это метод разделения, использующий преимущества и аффинной хроматографии, и электрофореза в иолиакриламидном геле [23, 24]. В микромасштабе он позволяет быстро анализировать смеси белков с избирательным разделением тех компонентов, которые обладают связывающими участками, комплементарными к иммобилизованным специфическим аффинным лигандам. Последние ковалентно связаны с частью матрицы полиакриламидного геля и образуют, таким образом, слой аффинного геля . Принцип этого метода хорошо иллюстрируется на типичном примере разделения активных белков аффинным электрофорезом, как показано на рис. 7.4. В стеклянных трубках равного диаметра готовят [c.166]

Исс,ледуемый материал наносится в виде узкой полосы иа поддерживающую среду приблизительно посередине между сосудами с буферным раствором, в которых находятся электроды. Каждый из компонентов мигрирует с определенной скоростью, зависящей от его заряда, к катоду или к аноду. В результате все компоненты четко разделяются. После этого носитель можно разрезать на соответствующие части и элюировать каждый из компонентов смеси. Таким образом, зонный электрофорез можно с успехом использовать как для анализа многокомпонентных смесей, так и д.пя препаративного выделения чистых белков. Выбор носителя для зонного электрофореза зависит главным образом от задачи, которая стоит перед экспериментатором. Если основной целью является разделение компонентов, то в качестве носителей используются бумага, крахмал или лучше полиакриламидный гель. Если же целью яв.ляется препаративное получение чистого белка, то лучше всего использовать крахмальный блок, на который [c.77]

Молекулярный вес, определяемый по формуле (Х.6), не всегда равен средневесовому молекулярному весу. Это отчасти связано с тем, что при его вычислении используется отношение з к О. Дело в том, что в случае полидисперсных систем с более или менее непрерывным распределением молекулярных весов метод скорости седиментации неприменим, и вместо него нужно пользоваться каким-либо из методов, описанных ниже. В случае гомогенных или гетеродисперсных систем, состоящих из дискретного набора компонентов, измерения скорости седиментации, дополненные измерениями диффузии, позволяют правильно определять молекулярные веса. Разделение компонентов гетеродисперсных белковых смесей с помощью ультрацентрифуги сыграло большую роль в развитии науки, поскольку таким путем было установлено, что белки — это индивидуальные вещества, а не беспорядочные конгломераты молекул меньших размеров. [c.190]

Важным результатом, полученным при изучении электрофореза растворов белков, было открытие того, что многие белки, которые являются чистыми по другим критериям, в действительности состоят из нескольких видов молекул. Ярким примером этого может служить яичный альбумин (рис. 125). Этот белок кристалличен (поэтому свойственно предположить, что все молекулы являются почти абсолютно идентичными) и показывает однородность в ультрацентрифуге (отсюда следует, что все молекулы имеют один и тот л<е молекулярный вес и коэффициент трения). Этот белок также показывает однородность в экспериментах по электрофорезу при различных условиях, таких, какие использовал Лонгворс, чтобы получить данные, представленные на рис. 123 (см. также рис. 125, верхнюю диаграмму). Однако если используется поле большой напряженности и эксперимент проводится очень длительно, то появляются благоприятные условия для разделения компонентов с почти одинаковыми подвижностями. При данных условиях, как показывает рис. 125, было найдено, что чистый белок состоит из трех отдельных компонентов. Предполагают , что эти три компонента являются идентичными во всех отношениях, кроме количества фосфата, которое они содержат, причем в них могло быть два, один и ни одного фосфатного иона соответственно. Фосфат связан с белком через гидроксильную группу в боковой цепи, и каждая фосфатная группа, [c.489]

Разделение смесей белков. Фронтальный электрофорез широко применялся для анализа белковых смесей, особенно белков сыворотки крови, а также смесей, экстрагированных из самых различных органов и тканей животных и растений. Качество разделения и точность определения состава резко зависят от состава, pH и ионной силы буфера. Так, для сыворотки крови обычно рекомендуют вероналовые буферные системы при pH около 8. Важным правилом является такой выбор pH, когда все компоненты смеси заряжены одноименно — это уменьшает опасность ассоциации компонентов и выпадения осадка. [c.64]

Следует учитывать также, что условия рехроматографии никогда не бывают вполне идентичными таковым при первичной хроматографии смеси белков при рехроматографии отсутствуют белковые компоненты, которые могут играть роль компонентов-вытеснителей при первичной хроматографии кроме того, при повторном диализе перед рехроматографией могут быть устранены и некоторые низкомолекулярные примеси. В ряде случаев применение градиентной элюции может дать лучшее разделение компонентов смеси, чем ступенчатое. [c.227]

Кривые элюирования, полученные на колонке такого типа, требуют тщательной расшифровки, поскольку механизм процесса, лежащего в основе такого метода, отличается от механизма распределительной и ионообменной хроматографии. В процессе адсорбционной хроматографии встречается значительное размывание вытекающих зон (образование хвостов ), за исключением тех случаев, когда состав элюирующего раствора таков, что значение вымываемого вещества приближается к единице. Успех фракционирования смеси белков зависит от подбора таких концентраций буферного раствора, которые достаточно различаются по ионной силе, чтобы обеспечить четкое разделение компонентов смеси на фракции при элюировании их с колонки. Во многих случаях последовательное элюирование белков проходит без помех, но необходимо помнить, что пики, полученные из смеси неизвестных белков, могут содержать несколько белков в каждой элюируемой зоне. Наряду с этим можно ожидать, что один белок, обладающий сильно изогнутой изотермой, будет давать отдельный пик при каждом приращении ионной силы в более широкой зоне элюирования. Адсорбционную хроматографию легко спутать с другими формами хроматографии. Наилучшим критерием первого механизма является отсутствие пропорциональности между длиной колонки и абсолютным положением пика на кривой элюирования. В случае истинного распределительного или ионообменного механизма разделения объемы элюирования данного растворенного вещества прямо пропорциональны длине колонки. [c.224]

Эти системы осуществляют начальный метаболизм питательных веществ. Они включают также и механические процессы — заглатывание и измельчение ппщп, экскрецию бесполезных и вредных продуктов переработки пищи. Значительную роль играют и физико-химические факторы, связанные с дальнейшим разделением компонентов пищи и частичным их перевариванием, что нередко осуществляется с помощью симбионтных микроорганпз.мов (микроорганизмы сычуга жвачных, микроорганизмы зоба насекомых, микроорганпзмы толстой кишки теплокровных и задней кишки насекомых). Стадия переваривания пищи включает разрушение более крупных молекул до более простых, которые затем используются для последующих превращений. При этом полисахариды расщепляются на простые сахара, белки на аминокислоты, жиры частично усваиваются непосредственно п частично расщепляются на жирные кислоты и глицерин. [c.28]

Применение. Обнаружение первичных аминокислот, пептидов, белков [228]. Для обнаружения альдегидов наносят на пластинку пробу, сверху наносят 5 мкг анилина и элюируют соответствующнл растворителем. Детектируют разделенные компоненты, как описано выше [229]. Первичные амины дают пятна с аквамариновой или желтой флуоресценцией, для пятен вторичных аминов характерна яркая пурпурная флуоресценция с постепенным затуханием, переходящая в желтую, если обработать пластинку 5-диметиламинонафталин-1 -сульфонилхлори-дом [230]. [c.251]

Приведенные результаты показывают, что метод пиролитической газовой хроматографии можно с успехолг использовать для идентификации белков, пептидов и аминокислот, в частности фракций, разделенных методом жидкостной хроматографии. Пиролитическую хроматографию можно непосредственно сочетать с жидкостной. В жидкостно.м хроматографе с пламенно-ионизационным детектором имеется устройство для пиролиза разделенных фракций. Если при записи хроматограммы в какой-то момент времени часть продуктов пиролиза направить не прямо в детектор, а через хроматографическую колонку, то можно получить пирограмму компонента, соответствующего данному пику. Такая методика весьма напоминает хроматомасс-спектрометрию, примененную к нелетучим соединениям, и позволяет провести идентификацию разделенных компонентов. [c.62]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология