Гель-фильтрация в тонком слое

ГЕЛЬ-ФИЛЬТРАЦИЯ В ТОНКОМ СЛОЕ [c.162]

В нашей лаборатории гель-фильтрация в тонком слое сефадекса 0-150 используется для анализа фрагментов молекул иммуноглобулинов, полученных при ферментативном гидролизе. 5,0 г се- [c.239]

Фиг. 36. Зависимость между молекулярным весом различных белков (см. табл. 22 и 24) и относительной длиной пути (/ ) при проведении гель-фильтрации в тонком слое сефадекса 0-200 (за единицу принята длина пути цитохрома с) [68].

Гель-фильтрация в тонком слое и ее модификации [c.256]

До настоящего времени гель-фильтрация в тонком слое находила применение главным образом при разделении белков. Разработаны модификации метода, сочетающие гель-фильтрацию с электрофорезом и иммунной преципитацией. Настоящая глава посвящена методическим аспектам тонкослойной гель-фильтрации, некоторым приложениям метода, а также указанным модификациям. Большое внимание, уделяемое разделению белков, отражается и в подборе конкретных примеров. Однако это не означает, что область применения метода ограничивается этой группой веществ. [c.256]

МЕТОДИКА ГЕЛЬ-ФИЛЬТРАЦИИ В ТОНКОМ СЛОЕ [c.256]

Гель-фильтраций в тонком слое 263 [c.263]

При сопоставлении образцов свежего молозива и выделенных из него JgA оказалось, что JgA идентичны по величине молекул. Это послужило серьезным доводом в пользу того, что большие размеры JgA молозива нельзя объяснить полимеризацией в процессе выделения. JgA молозива и большинства других секретов содержит дополнительный секреторный компонент, отсутствующий в сывороточном JgA. Гель-фильтрацией в тонком слое сефадекса G-150 было показано, что он по своим размерам примерно соответствует димеру легких цепей иммуноглобулинов [35]. При изучении белков молозива свиньи Портер и сотр. [70] использовали тонкослойную гель-фильтрацию на сефадексе G-200 для оценки изменений в составе белков в первые четыре недели лактации. [c.266]

Что касается самого процесса ТСХ, то здесь можно усмотреть далеко идущую аналогию с жидкостной хроматографией на колонках. Неподвижную фазу образует н идкость, связанная со слоем фиксированного на подложке гранулированного сорбента, свойства и характеристики которого близки, а иногда даже идентичны таковым для материалов, используемых в качестве носителей неподвижной фазы в колоночной хроматографии. Здесь используются те же производные целлюлозы или силикагеля, к которым надо добавить только полоски ацетилцеллюлозы. Подвижную фазу образует жидкий элюент с аналогичными, рассмотренным ранее свойствами. Неизменной остается и сущность хроматографического процесса, базирующегося на равновесном распределении вещества между неподвижной и подвижной фазами. Как и в любом хроматографическом процессе (гель-фильтрация в тонком слое была рассмотрена в гл. 4), для целей хроматографического фракционирования это распределение должно быть сильно сдвинуто в пользу неподвижной фазы. Из всех вариантов хроматографпп для разделения компонентов белков и нуклеиновых кислот методом ТСХ (сами биополимеры очень редко выступают здесь в качестве объектов) практически пспользуют только два нормальнофазовую распределительную и ионообменную. [c.458]

Тонкослойный вариант гель-фильтрации был предложен Детер-маном [6], а также Иоханссоном и Римо [11 ] и оказался весьма полезным для микроанализа и быстрого сравнительного анализа нескольких образцов исследуемого материала. Эндрюс [1 ], а позднее Моррис [12] применили тонкослойную гель-фильтрацию для определения молекулярного веса белков на основе установленной ими линейной зависимости между логарифмом молекулярного веса данного белка и расстоянием, пройденным им в слое данного носителя за определенный помежуток времени. В соответствии с этим можно ориентировочно определять молекулярные веса неизвестных белков, если одновременно проводить гель-фильтрацию стандартных белков известного молекулярного веса. Когда исследователь располагает достаточно чувствительными методами обнаружения белка в слое носителя, для определения молекулярного веса достаточно всего лишь нескольких микрограмм исследуемого материала. При определении молекулярного веса белков гель-фильтрацией в тонком слое следует иметь в виду, что подвижность данного белка при хроматографии в гель зависит не только от молекулярного веса, но и от формы его молекул. Поэтому определение молекулярного веса с помощью гель-хроматографии правомерно лишь в том случае, когда форма молекул исследуемого белка незначительно отличается от < рмы молекул стандартных белков, используемых для калибровки. [c.238]

Комбинированное использование тонкослойной гель-фильтрации с электрофорезом или иммунодиффузией до настоящего времени представляет собой один из наиболее тонких методов микроанализа белков. Хансон и др. [10] разработали метод двумерного разделения, используемый для анализа белков. На первом этапе белки подвергают гель-фильтрации в тонком слое сефадекса G-200 или G-100, а на втором — электрофорезу. Они предложили прибор, в котором хроматографическую пластинку можно закреплять под углом для гель-фильтрации и горизонтально для электрофореза. В описанных экспериментах использовали стеклянные пластинки размером 30 x 30 см и толщиной 1 мм, на которые наносили слой геля сефадекса толщиной 0,5 мм. Для набухания сефадекс оставляли в 0,05 М вероналовом буферном растворе pH 8,6. Сначала проводили гель-фильтрацию, а затем в направлении, перпендикулярном первому, в течение 3 ч вели электрофорез при градиенте напряжения 10 В/см. Этот метод весьма успешно был применен для анализа сывороток крови человека, спинномозговой жидкости и гормона роста. [c.240]

Уолхейм и Снигурович [21] пользовались препаративным вариантом гель-фильтрации в тонком слое для изучения частоты легких цепей типа й и Я, в моноклональных иммуноглобулинах М. После гель-фильтрации в слое сефадекса 0-200 часть геля, содержащую макроглобулин, переносили в пробирки, белок элюировали, концентрировали элюат, а затем подвергали [c.264]

Впервые методика гель-фильтрации в тонком слое описана в работах Детермана [5], а также Иоханссона и Римо [6]. Детерман применил для этой цели сефадекс 0-25 в виде слегка под- [c.256]

Гель фильтрация в тонком слое применяется преимущественно при исследовании белков и гораздо реже в других областях биохимии. Гроссман и Вагнер [23] использовали тонкослойную гель-фильтрацию на сефадексе 0-25 для идентификации компонентов нитросинего тетразолийхлорида, применяющегося обычно для гистохимических целей. Стикланд [24] тонкослойной хроматографией на дауэксе-1 и сефадексе 0-25 удалял из образцов полисахариды и флуоресцирующие примеси, которые обычно интерферируют при фракционировании 5-рибонуклеотидов в тонком слое ОЕАЕ-целлюлозы. Возможность разделения низкомолекулярных соединений в тонком слое сефадекса 0-10 и 0-15 вообще почти не исследовалась. Зюдвиг и сотр. [68] показали, что разделение различных антибиотиков на сефадексе 0-15 зависит от их адсорбции на геле. Не сделано никаких попыток использовать в тонкослойной хроматографии менее гидрофильные гели, например сефадекс ЬН-20. [c.263]

О высокой эффективности разделения белков гель-фильтрацией в тонком слое свидетельствуют результаты модельного опыта, приведенные на рис. 2. В этом случае на тонком сефадексе 0-75 достигнуто полное разделение смеси, содержащей а-лактальбумин, р-лактоглобулин и альбумин из сыворотки быка более того, альбумин дал два пятна, соответствующие мономеру и димеру. При фракционировании на колонке такого разделения достигнуть не удалось [6]. Иоханссон и Римо [8] получили удовлетворительное разделение сывороточных белков на сефадексе 0-200. Белки нормальной сыворотки человека были [c.263]

При исследовании компонентов моноклонального иммуноглобулина Гоббс [15] применил тонкослойную гель-фильтрацию сыворотки в сочетании с зональным электрофорезом и иммуноэлектрофорезом. Такое сочетание эффекта молекулярных сит и иммунной преципитации позволило обнаружить очень интересный компонент иммуноглобулина, представляющий собой половину молекулы иммуноглобулина О [26]. Парвес [27] предложил применять гель-фильтрацию в тонком слое для диагностики болезни тяжелых цепей , характеризующейся присутствием в сыворотке и моче больных аномального белка, напоминающего тяжелую полипептидную цепь иммуноглобулина О (или А). Этот пример приведен на рис. 3. [c.264]

Автор также применял гель-фильтрацию в тонком слое при исследовании иммуноглобулинов. Отделение фрагментов протео-литического гидролиза от исходного иммуноглобулина О с помощью гель-фильтрации на колонке впервые было описано Хансоном и Иоханссоном [31] Иоханссон и Римо [6] предложили использовать для этой цели гель-фильтрацию в тонком слое. По мнению некоторых авторов, гель-фильтрация в тонком слое является удобным методом анализа при подборе оптимальны.х [c.265]

Следует привести еще несколько примеров успешного применения гель-фильтрации в тонком слое. Линк [36] показал, что фракционирование в тонком слое можно проводить в присутствии 8М мочевины или 6,5 М хлоргидрата гуанидина. В этих условиях он сопоставил скорости миграции нативного и модифицированного (восстановленного и алкилированного) р-белка из спинномозговой жидкости. Совпадение скорост-ей миграции обоих образцов указывало на отсутствие в белке субъединиц с различным молекулярным весом. В сочетании с электрофорезом тонкослойную гель-фильтрацию применяли как удоб1у>1й метод контроля при выделении аминоацил-т-РНК-синтетаз [37]. При сопоставлении результатов анализа путем тонкослойной гель-фильтрации на G-200 двух фракций с валил-т-РНК-синтетазной активностью, но несколько различавшихся в функциональном отношении, оказалось, что обе фракции довольно близки по размерам молекул [38]. Радола [67] использовал тонкослойную гель-фильтрацию для решения ряда задач к ним относится анализ сывороточных белков животных и человека, растворимых белков культуры клеток млекопитающих in vitro, растворимых белков из листьев шпината. [c.266]

Сочетание иммунодиффузии с гель-фильтрацией в тонком слое представляет собой чувствительный метод, напоминающий и дополняющий иммуноэлектрофорез. Далее мы называем этот метод имм шо-гель-фильтрацией, хотя были предложены и другие термины, например, иммунохроматография [17, 53] и гелевая иммунофильтрация [54]. Известно несколько вариантов этого метода 13—15, 17, 53—55]. Грант и Эвералл [54] проводили иммунодиффузию в слое сефадекса. Хотя в цитируемых здесь работах приводятся отличные спектры иммунопреципитации, эта методика, как отмечают сами авторы, имеет ряд недостатков [56, 57]. [c.271]

ТОГО, с ПОМОЩЬЮ ТСХ можно контролировать результаты разделения, проведенного другими способами, например перегонкой, колоночной хроматографией, рекристаллизацией и т. п. Можно также использовать ТСХ для предварительной оценки структуры хроматографируемого соединения. Область применения ТСХ, которая с самого начала ее развития была достаточно широкой [38, 76], еще более расширилась благодаря универсальности метода (непрерывное и двумерное элюирование, электрофорез и гель-фильтрация в тонком слое). Благодаря своим преимуществам метод ТСХ часто вытесняет, а во многих случаях уже вытеснил бумажную хроматографию, в которой также используется плоскостное расположение хроматографической системы. Одпако в последнее время количество опубликованных статей, посвященных ТСХ, несколько уменьшилось, несмотря на то что разработаны новые модификации метода, увеличивающие его разрешающую способность и чувствительность [22а, 54а]. [c.86]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология