Седиментация в препаративной центрифуге

Однако рассматриваемое равновесие может быть сдвинуто в сторону преобладания седиментации при замене гравитационного поля центробежным со значительно большим ускорением, создаваемым действием центрифуги или ультрацентрифуги. Этот метод, впервые использованный Думанским и получивший развитие в работах Сведберга и его школы, позволяет в настоящее время создавать ускорения до 10 —и благодаря этому производить не только седиментацию коллоидных частиц, но даже и седиментационное разделение молекул разной массы. Применение ультрацентрифуг дает возможность проводить наряду с дисперсионным анализом коллоидных систем и растворов высокомолекулярных соединений также препаративное разделение их на фракции. [c.156]

Очень компактное и вместе с тем полное руководство по применению ультрацентрифугирования в современных биологических исследованиях. После краткого исторического обзора и описания наиболее распространенных ультрацентрифуг автор последовательно рассматривает принципы и возможности оптических систем, используемых в аналитических центрифугах, способы измерения коэффициентов седиментации и диффузии, важнейшие методы определения молекулярной массы, основы количественного анализа смесей, а также методы препаративного ультрацентрифугирования. [c.4]

В следующих разделах описана в общих чертах теория каждого метода центрифугирования, а также следующие аппараты 1) низкоскоростная ультрацентрифуга, применяемая для определения кривых распределения коллоидных частиц, 2) высокоскоростная ультрацентрифуга с масляной иди воздушной турбиной для определения констант седиментации органических макромолекул, 3) равновесная ультрацентрифуга, применяемая для соединений с молекулярным весом порядка нескольких тысяч, и 4) препаративная воздушная центрифуга для выделения и очистки таких высокомолекулярных веществ, как вирусы. Для каждого аппарата описана методика проведения измерений, а также специальные области применения и примеры проведенных исследований. [c.463]

При определении 5 с помощью зонального центрифугирования часто используют стандартные образцы (маркеры), значения з которых предварительно были определены методом аналитического ультрацентрифугирования. Однако даже в том случае, когда концентрация достаточно низка, чтобы можно было не принимать во внимание концентрационную зависимость седиментации (которая может достигать большой степени, если материал недостаточно чист), определение с помощью зонального центрифугирования имеет подводные камни, которые не встречаются в аналитическом ультрацентрифугировании. Это можно объяснить тремя основными причинами. Во-первых, плотность и вязкость раствора увеличивается вдоль пробирки, поэтому суммарная сила, действующая на молекулу, здесь уже не является простой функцией расстояния. Во-вторых, стенки препаративных пробирок параллельны, поэтому они не совпадают с направлением седиментации, в результате чего происходит седиментация по стенкам с накоплением вещества. Это накопление приводит к локальным инверсиям плотности, вызывая некоторую конвекцию. В-третьих, значение 8 рассчитывается только по двум точкам, положению при времени, равном нулю, и после остановки центрифуги, так что истинная скорость движения остается неизвестной. Первая причина может быть рассмотрена очень сложным теоретическим путем, вторая теоретически описана, однако влияние ее на 5 до конца не установлено. Для избежания трудностей, связанных с первой причиной, обычно применяют изокинетические градиенты, т. е. концентрацию и плотность градиента подбирают таким образом, чтобы молекулы двигались с постоянной скоро- [c.311]

С применением соответствующей ячейки мон но выполнить эксперименты в градиенте плотности в аналитической центрифуге, использовав таким образом преимущества в чувствительности ультрафиолетовой оптики [1845]. При этом образец небольшого объема (15 мкл) вводится в колонку жидкости с высокой плотностью. Во время седиментации образуется градиент, который стабилизирует зоны седиментирующих частиц. При такой процедуре удается обнаружить примерно до 0,2 мкг вируса или другого нуклеопротеида. Одиако при этом нельзя препаративно выделить фракции градиента, как это делается при применении бакет-ротора. [c.28]

Лоунстейном и Бирнбаумом, которые сконструировали аппаратуру, основанную на использовании модифицированной препаративной центрифуги, которая позволяет одновременно измерять 5 и Д при изучении седиментации полимеров в капилляре с помощью фотодетектора, сканирующего капилляр, причем градиент плотности сахарозы не используется [50]. В другой недавно опубликованной работе [51] описывается разделение смесей заряженных полиэлектролитов в колонке с полиакриламидным гелем путем электрофореза с периодическим включением электрического поля и последующее определение Д для фракций методом КРЛС. [c.188]

Пикельс [281] развил теорию седиментации для центрифуги с наклонным расположением пробирок и показал, что, зная седи-ментационную константу, можно предсказать условия, необходимые для успешного разделения при помощи препаративного ротора. Пикельс установил также, что в связи с наложением конвекционных явлений на процесс седиментации невозможно достигнуть полного разделения всех, тяжелых компонентов. [c.66]

Важным нововведением является установка измерителя температуры в середине ротора этой ультрацентрифуги. Это оказалось возможным благодаря успешной разработке надежной системы передачи сигнала, позволяющей регистрировать изменения температуры вращающегося ротора. Во время работы центрифуги заданная температура поддерживается с точностью 0,ГС, что достигается применением системы термоэлектрического охлаждения с батареями Пельтье. В температурном интервале от —5 до +25° С, характерном для основной массы препаративных и аналитических работ, температура ротора сохраняется постоянной с точностью 0,05° С. Скорость вращения может регулироваться непрерывно в диапазоне от 1500 до 60 000 об/мин. Ультра-центрифуга hrist оснащена шлирен-системой, интерференционной и ультрафиолетовой системами. Интерференционная система позволяет работать с сильно разбавленными растворами. Интерферограммы могут быть представлены в виде кривых распределения Гаусса. Переход от шлирен-системы к интерференционной осуществляется поворотом рычага. Ультрафиолетовая система устанавливается на центрифуге независимо от других оптических систем. Оптическая плотность в ультрафиолетовой области регистрируется автоматически при помощи самописца или фотографируется. Градиенты концентрации во время седиментации регистрируются самописцем. Наряду с самописцем можно одновременно пользоваться фоторегистрирующей системой. За ходом седиментации можно следить и по изображению на матовом экране. Для фотографирования используются пластинки размером 5 X 25 см, рассчитанные на 6 снимков. Пластинки сменяются автоматически. На ультрацентрифуге hrist можно установить приставку для измерения диффузии, рассчитанную на большое количество ячеек. [c.34]

Центрифугирование в градиенте плотности основано на том же принципе. Как и в вышеуказанном случае, градиент плотности создается градиентом концентрации. В колонке градиент концентрации достигается тем, что слои с различной концентрацией помещают друг над другом, после чего начинается медленная диффузия, постепенно выравнивающая градиент. Роль сил тяготения сводится главным образом к стабилизации системы путем снижения до минимума конвекционных токов. Наоборот, при центрифугировании в градиенте плотности градиент концентрации является результатом сил, действующих в центрифуге, и достигает равновесного значения. Установленный таким образом градиент плотности достаточно стабилен. Этот эффект был использован Пикельсом [2] для снижения конвекции в опытах по центрифугированию. Такой же принцип применяли Калер и Ллойд [31 в своих опытах с так называемой стабилизированной движущейся границей в препаративной ультрацентрифуге. Другим применением градиента плотности является зонное центрифугирование —методика, разработанная Брекке [4], которая позволяет разделять компоненты смеси полимеров на дискретные зоны. Предварительно создают градиент плотности, так что ни в одной точке плотность не превышает плотности любого из компонентов исследуемого образца, раствор которого помещают сверху, а затем подвергают центрифугированию. Различные компоненты мигрируют в разные зоны, которые все более и более разделяются по мере центрифугирования. Еще до того, как движущаяся с наибольшей скоростьЕо зона достигнет дна кюветы, центрифугу останавливают и анализируют различные зоны. Очевидно, что метод основан на различиях в скоростях седиментации. Градиенту плотности принадлежит второстепенная ролы стабилизация системы и влияние плотности жидкости на скорость седиментации. [c.418]

Бимс и Пикельс [47] показали, что этот метод получения высоких скоростей вращения может быть использован в конструкции высокоскоростных центрифуг для химических и биологических исследований. Система пустотелого ротора, содержащего раствор и приводимого во вращение прямым воздушным приводом, оказалась непригодной для достижения необходимых скоростей седиг ментации. Поэтому Пикельс и Бимс [48] разработали конструкцию, в которой ротор, несущий кюветы центрифуги, подвешен в вакуумной камере к оси воздушной турбины, укрепленной над камерой. Подвеска осуществляется с помощью струнной проволоки, проходящей через масляный сальник. Эта установка постепенно совершенствовалась, и в настоящее время центрифугирование производится с помощью большого дюралюминиевого ротора с диаметром, примерно равным диаметру ротора Сведберга (180 мм), и с использованием аналогичных оптических систем для фотографирования хода седиментации белковых молекул и вирусов. Воздушная угловая ультрацентрифуга применялась для препаративного выделения вирусов (см., например, [49]). [c.503]

Седиментационные диаграммы иредставляют собой превосходное средство контроля за процессом фракционирования. Этим путем была проведена Квенселем [81] очистка глобулинов в солодовом экстракте (рис. 144). Первая диаграмма (рис. 144, А) показывает седиментацию первоначального неоднородного вещества и его же после диализа или обработки сульфатом аммония. Другие диаграммы (не приведенные) показывают разделение трех основных компонентов посредством фракционирования в растворах сульфата аммония и разделение а- и тг-глобулинов посредством тщательного подбора концентрации сульфата аммония. Рис. 144, Б показывает результат фракционного центрифугирования в препаративной воздушной центрифуге при 23 000 об/мин. Рис. 144, В — пример электрофоретического разделения. [c.546]

Определение коэффициента седиментации в препаративной ультрацентрифуге, В большинстве случаев коэффициент седиментации для многих вирусов животных невозможно определить в аналитической центрифуге, так как для проведения подобных измерений требуются значительные количества изучаемого агента в очищенном виде. В таких случаях для вычисления коэффициента седиментации вирусов используют косвенные методы. При этом скорость осаждения вирусных частиц определяют, измеряя инфекционпость вируссодержащей суспензии после ультрацентрифугирования. Для мелких вирусов коэффициент седиментации можно довольно точно определить в препаративной ультрацентрифуге. При исследовании крупных вирусов возможны ошибки, так как крупные вирусы могут прилипать к стенкам центрифужной пробирки во время ультрацентрифугирования. [c.16]