Моноклональные культуры

Получение моноклональной культуры [c.160]

Селективная среда — это среда, в которую добавляются вещества, подавляющие рост всех организмов, за исключением одного или нескольких. Примером может служить добавление пенициллина к культуре с целью отбора устойчивых к нему организмов, или отбор гибридных клеток в процессе производства моноклональных антител (разд. 12.11.2). [c.45]

Рис. 12.14. А. Сосуд со стартовой культурой клеток млекопитающих, используемой для производства моноклональных антител. В сосуде культивируют клетки гибридомы, которые затем используют для размножения в ферментере, чтобы получить антитела. Б. Опытная установка для коммерческой ферментации в биотехнологической лаборатории.

Были получены комплексы антител к поверхностным антигенам раковых клеток со многими неспецифичными противораковыми средствами, но далеко не всегда они оказывались эффективными. Вероятно, наиболее многообещающим является использование сильнодействующих растительных и бактериальных токсинов, одна молекула которых, как принято считать, может вызвать гибель клетки. Молекулы токсина дифтерии и рицина образованы двумя полипептидными цепями, связанными дисульфидными мостиками. Цепь В связывается с клеточной поверхностью, а цепь А, обладающая ферментативной активностью, проникает внутрь клетки и нарушает работу механизма биосинтеза белка. Были предприняты попытки заменить В-цепь токсинов специфическими антителами, преимущественно гомогенными. Недавно был получен препарат моноклональных антител к антигену раковых клеток прямой кишки, ассоциированных с А-цепью токсина, который избирательно действует на эти клетки в культуре. [c.333]

После отбора гибридомных клеток, синтезирующих интересующие исследователя антитела, можно приступить к их массовому наращиванию с целью получения больших количеств моноклональных антител. В начале культивирования гибридомные клетки могут расти медленно и плохо переносить низкую плотность посева. В связи с этим при пересеве клеток их надо разводить не более чем в 3—5 раз. Ускорению роста клеток может способствовать добавление клеток питающего слоя. Гибридомные клетки необходимо поддерживать в логарифмической фазе роста и избегать превышения концентрации клеток выше 0,5 млн/мл. Клетки можно культивировать как в стационарной культуре, так и в роллерной, а также в различного рода культиваторах (ферментерах). [c.117]

Для получения максимальной продукции моноклональных антител клеткам позволяют расти до предельной плотности. В такой культуре через определенное время наблюдается гибель гибридомных клеток. Надосадочная жидкость собирается, а клеточный осадок отбрасывается, т. е. не пытаются культивировать дальше оставшиеся в живых клетки. [c.117]

Своеобразие рассматриваемых процессов состоит также в том, что. конечный продукт, находящийся первоначально в очень сложной смеси растворенных в воде веществ, должен быть получен со степенью чистоты, определяемой его последующим применением, т. е. с чистотой фармакопейных препаратов. Такая задача была бы крайне трудной, если бы не возможность использования специфических антител. Действительно, промышленное производство моноклональных антител из культур клеток, полученных методами клеточной инженерии (гибридомная техника), оказалось тем биотехнологическим производством, которое дало гигантский эффект в методах выделения особо чистых биопрепаратов. Иммобилизация моноклональных антител,. специфическим антигеном которых является, например, аг-интерферон, позволяет выделять последний в чистом виде из жидких смесей любого состава, пропуская их через колонку, в которой целевой продукт задерживается на твердом носителе, несущем антитело, а все остальные компоненты раствора, не дающие реакции антиген—антитело , проходят неизменными. После промывки комплекс интерферона с антителом легко разрушается и продукт получается в чистом виде. [c.28]

Готовят разведение антител (антисыворотки или препарата моноклональных антител) в растворе ФСБ—твин. Степень разведения зависит от содержания антител. При анализе забо леваний, вызываемых паразитами, мы обычно работали с разведением сыворотки 1 200—1 1000. При использовании супернатантов моноклональных культур обычно готовили разведение 1 2—1 100, а в случае жидкости из моноклональных асцитов — [c.346]

После иммунизации, даже монодетерминантным антигеном, в пуле иммуноглобулинов, синтезируемых совокупностью клеток, содержатся антитела, различающиеся между собой, т. е. сыворотки содержат поликлональные антитела. Эта гетерогенность антител обусловлена тем, что каждый плазмоцит вырабатывает только один тип, вид, класс, подкласс антител. Следовательно, каждая клетка или ее потомство, клон вырабатывают свой тип антител, получивших название моноклональных. Принципиально моноклональные антитела можно получить искусственно, культивируя каждую антителопродуцирующую клетку, т. е. получая моноклональную культуру клеток. Однако практически это трудно осуществимо. Поэтому гибридную клетку получают путем слияния иммунного антителопродуцирующего В-лимфоцита, т. е. лимфоцита, взятого от иммунного животного и раковой миеломной клетки. Такая гибридома приобретает свойства ро- [c.156]

Число разных активных центров (центров связывания), образуемых лимфоцитами в форме антител, по примерным оценкам, составляет 10 это значительно больше (примерно на два порядка), чем число разных центров связывания, образуемых в форме всех других белков всеми другими клетками, вместе взятыми. Разнообразию антител соответствует разнообразие В-лимфоцитов. Как показали опыты по культивированию лимфоцитов in vitro, колония клеток, выращенных из одной клетки (моноклональная культура), синтезирует антитела одного типа. Моноклональные колонии, выращенные из разных клеток лимфоцитов, синтезируют разные антитела. Следовательно, популяция лимфоцитов в организме гете-рогенна существует клонов лимфоцитов, каждый из которых синтезирует антитела только одного типа. Общее число лимфоцитов в теле человека составляет 10 следовательно, они образуют 10 клонов по 10 клеток в каждом клоне (все приведенные величины являются приближенными). [c.478]

На регуляцию морфогенеза существенно влияет качество света. Показано (Л. Коппель, 1992), что морфогенный каллус образуется чаще на синем свету, чем на белом или красном. Изменения на уровне индивидуальных белков во время реализации морфогенетической программы в культуре тканей позволили говоррггь о существовании белков развития. Однако отсутствие специфических тестов на эти белки не позволяет их выяврггь. Вместе с тем при использовании гибридов, продуцирующих моноклональные антитела на мембранные белки соматических зародышей, удалось выявить полипептид с молекулярной массой 45 кДа, который встречается в ядре нескольких видов растений и возможно участвует в регуляции клеточного деления (Г. Смит и др., 1988). В настоящее время большое внимание уделяется генетическому аспекту морфогенеза, изучению соматического эмбриогенеза как генетически наследуемого признака. Роль основного двигателя процесса развития отводится дифференциальной активности генов. Предполагается, что гены, контролирующие соматический эмбриогенез, начинают экспрессироваться в критические периоды развития эмбриоидов (H.A.Моисеева, 1991). [c.176]

Следовательно, для практического применения антител в качестве диагностического инструмента или компонентов терапевтических средств необходимо было создать такую линию клеток, которая росла бы в культуре и продуцировала антитела одного типа, обладающие высоким сродством к специфическому антигену-мишени, - моноклональные антитела. Подобная клеточная линия могла бы стать неиссякающим источником идентичных молекул антител. К сожалению, В-лимфоциты (В-клетки), синтезирующие антитела, не могут воспроизводиться в культуре. Решение данной проблемы виделось в создании гибридной клетки. Получив генетическую составляющую от В-клетки, она могла бы вырабатывать антитела, а приобретя способность к делению от клетки совместимого типа — расти в культуре. Было известно, что В-лимфоциты иногда перерождаются и становятся раковыми (миеломными) клетками, приобретая спо- [c.184]

Рис. 9.2. Скрининг клеток, вырабатывающих моноклональные антитела. Вьщеляют клетки селезенки мыши, иммунизированной специфическим антигеном, и проводят их слияние с клетками миеломы, не вырабатывающими антитела. Слившиеся клетки отбирают по способности к росту на среде ГАТ (гипоксантин, аминоптерин, тимидин). Клетки, вырабатывающие специфические антитела к иммунизирующему антигену (клетки гибридомы), идентифицируют иммунологическими методами и субкультиви-руют, чтобы получить отдельные клоны. Из гибридомы, растущей в культуре и секрсти-рующей единственный тип молекул антител, получают моноклональные антитела.

Лекарственные вещества, связанные с моноклональными антителами Лекарственные вещества, проявляющие высокую активность при тестировании in vitro (обычно в культуре клеток), зачастую оказываются значительно менее эффективными in vivo. Кажущееся снижение их активности объясняется тем, что они не достигают органа или клетки-мишени в нужной концентрации. Увеличение дозы принимаемого препарата не решает проблему, поскольку при этом часто возникают побочные эффекты. Более того, чтобы избежать таких эффектов, многие терапевтические средства заведомо вводят в дозах, не достигающих оптимальных, что дополнительно снижает их эффективность. Для облегчения доставки лекарственного вещества к месту его действия используют несколько приемов. 1. Заключают его в особые частицы - липосомы, липидная обо- [c.212]

Гибридомы, подобно большинству других клеточных культур животных, растут относительно медленно, не достигают высокой плотности и требуют сложных и дорогих сред. Получаемые таким образом моноклональные антитела очень дороги, что не позволяет широко использовать их в клинике. Чтобы решить эту проблему, были предприняты попытки создания своего рода биореакторов на основе генетически модифицированных бактерий, растений и животных. Для эффективной доставки и функционирования некоторых иммунотерапевтических средств зачастую достаточно одной антигенсвязывающей области антитела (Fab- или Fv-фрагмента), т. е. присутствие F -фрагмента антитела необязательно. [c.218]

Растения дают большое количество биомассы, а выращивание их не составляет труда, поэтому разумно было попытаться создать трансгенные растения, способные синтезировать коммерчески ценные белки и химикаты. В отличие от рекомбинантных бактерий, которых культивируют в больших биореакторах (при этом необходимы высококвалифицированный персонал и дорогостоящее оборудование), для выращивания сельскохозяйственных культур не нужно больших средств и квалифицированных рабочих. Основная проблема, которая может возникнуть при использовании растений в качестве биореакторов, будет связана с выделением продукта введенного гена из массы растительной ткани и сравнительной стоимостью производства нужного белка с помощью трансгенных растений и микроорганизмов. Уже созданы экспериментальные установки по получению с помощью растений моноклональных антител, функциональных фрагментов антител и полимера поли-Р-гидроксибутира-та, из которого можно изготавливать материал, подверженный биодеградации. [c.412]

Выявление с помощыо прямой РИФ. Как и при ИЭМ, в данном случае происходит взаимодействие вирусных антигенов с АТ диагностической иммунной сыворотки или моноклональными антителами (см. подразд. 1.4.5). С помощью РИФ также удается обнаружить специфический вирусный антиген в культурах клеток, инфицированных вирусом. [c.267]

Для антигенной идентификации вирусов в клеточных культурах можно также использовать РПГ, РСК, РИФ, РОПГА ИФА, РИА со специфическими иммунными противовирусными сыворотками или моноклональными АТ. Методики этих реакций описаны в подразд. 3.2. [c.272]

В противоположность суспензионным культурам клеток на микроносителях разработаны способы инкапсулирования их в полимерные сферы (полилизиновые, агарозные, из полимерных смол), когда клетки, по-существу, не испытывают того механического напряжения, которое они должны проявлять в свободном виде. Эти способы оказались выгодными для культивирования гибридом в целях получения моноклональных антител. Диаметр микрокапсул, размер пор в них и их толщина могут быть независимо проконтролированы в процессе изготовления и оптимизированы для конкретного типа гибридом. Например, согласно данным фирмы Damon Biote h (Германия) гибридомные клетки человека или животных вначале суспендируют в биосовместимом растворе [c.541]

ДЛЯ синтеза пуринов. Клетки селезенки не обладают таким генетическим дефектом и поэтому миеломные клетки, не синтезирующие нуклеотиды, через определенноезремя исчезают из культуры. Гибридомы остаются единственными делящимися клетками. Тогда через сутки инкубации 50% объема среды заменяют на среду, содержащую Ю М гщюксантина, 10 М аминоптерина и 4 10 М тимидина (среда ГА1 ). Среду сменяют каждые сутки в течение двух дней, а затем — один раз через 48 часов. Примерно через 2 недели гибридомы начинают активно расти. Необходимо следить, чтобы не было слишком густого роста — признак развития поликлональной популяции негустая суспензия клеток обеспечивает рост моноклональных гибридом (выживаемость клеток при этом невысокая). [c.575]

Рис. 163. Схема получения моноклональных антител с помощью габридом-ной техники АС — агент слияния клеток, 1 —В-клетки из селезенки иммунной мыши, 2 — культура миеломных клеток мыши, 3 — гибридизация, 4 — гибридомы, 5 — селекция и клонирование гибридом, 6 — гибридомы, образующие моноклональные антитела, 7 —- введение гибридом, образующих моноклональные антитела, в организм сингенной мыши, 8 — клетки гибридомы, образующие моноклональные антитела, культивируемые в виде культуры ткани, 9 — выращивание гибридомных клеток, образующих моноклональные антитела, в ферментаторе, 1дкж — иммуноглобулины в культуральной жидкости, 1дас — иммуноглобулины в асцитической жидкости, 10 — высаливание 1д-ов аммония сульфатом, 11 — стандартизация 1д-ов, 12 — лиофили-зация 1д-ов.

Созданы и применяются в производстве высокочувствительные диагностические препараты на основе метода ИФА (иммуноферментного анализа), ДНК-зондов, внедрения полимеразной цепной реакции (ПЦР).Используются моноклональные антитела, полученные методом гибридомной технологии. Получены генетически трансформированные кролики с геном асРНК, устойчивые к вирусам лейкоза, а также трансгенные кролики с геном альфа-2 интерферона. Разработана рекомбинантная вакцина против лейкоза крупного рогатого скота на основе оспененного вектора. На культуре клеток нарабатывается антиген и производится диагностика лейкоза крупного рогатого скота. Генно-инженерные вакцины против ящура и сибирской язвы производятся в объемах, обеспечивающих потребности в них России, стран СНГ и ряда других государств мира. [c.428]

Клонирование фрагментов генома, содержащих ОРС, в экспрессирующих векторах позволяет нарабатывать для иммунизации большие количества чистого белка. Это делает получение моноклональных антител к белкам, кодируемым последовательностями ОРС, стратегически простой, хотя и в некоторой степени трудоемкой задачей. Основные требования при подобной работе— наличие хорошей культуры клеток и использование высокочувствительного метода анализа, позволяющего отличать антитела к продуктам ОРС от антител, узнающих векторные фрагменты гибридного белка. Отлаживание такого метода— основное узкое место рассматриваемого подхода. После получения специфических моноклональных антител к продукту, кодируемому встроенным фрагментом, их можно использовать для выявления, количественного анализа и очистки белкового продукта ОРС. [c.180]

Хотя, как указывалось выше, клеточные культуры и находили применение в иммунологии, в течение ряда лет использование этой системы осложнялось следующим обстоятельством. Клетки, синтезирующие интересующие исследователей антитела (например, клетки селезенки животных, иммунизированных специфическими антигенами), плохо росли в культуре или совсем не росли, а клетки миеломы продуцировали антитела с неизвестной специфичностью (разд. 15.4). Способность этих двух типов клеток к слиянию позволила в последнее время наладить крупномасштабное производство моноклональных антител (Kohler, Milstein, 1975). Если мышь иммунизировать неочищенным препаратом антигена и затем клетки ее селезенки гибридизовать с клетками миеломы, то среди полученных гибридных клеток найдется по крайней мере одна, продуцирующая антитела, специфические к исходному антигену. Эта клетка может быть клонирована (разд. 8.1) и трансплантирована в мышь в форме опухоли, продуцирующей высокоспецифические антитела в количестве, измеряемом граммами. Представляя безусловный интерес для иммунологов, это, кроме того, дает возможность биохимику получать антитела к материалу, который он не может должным образом очистить. Такие антитела могут быть, в частности, использованы для генетического анализа антигенов поверхности клеток человека (Barnstable et al., 1978). [c.12]

Последние достижения в этой области включают получение антиидиотипических антител [8 ] и моноклональных антител овцы [9 ] межвидовым слиянием клеток. Кроме того, получены моноклональные антитела человека как из гибридом, образованных с помощью внутри- или межвидового слияния клеток, так и из культуры В-лим цитов, трансформированных вирусом Эпштейна - Барра (ВЭБ) [10]. Другими большими достижениями, важными для практики, являются получение биспецифических антител (т.е. специфических к определяемому веществу и метке) из гибридных гибридом [11-13] и создание химерных антител (в целях преодоления сверхчувствительности к ксеногенному материалу) с по- [c.37]

Стеркльность. Поддержание стерильных условий в течение всего процесса является необходимым условием. Микробное заражение возможно как на стадии приготовления среды, так и в ходе культивирования. Время культивирования изменяется от 1-2 недель в периодическом режиме до нескольких месяцев в проточном режиме. Предотвращение микробного и химического загрязнения обеспечивается особенностями конструкции ферментера и технологии процесса. Ферментеры и все связанные с ними трубопроводы и запорно-регулирующая аппаратура устроены так, что их можно, стерилизовать непосредственно перед началом культивирования, причем стерильность сохраняется в ходе всего процесса. Все операции с культурами и средами осуществляют только в закрытых сосудах. Степень сложности предприятия по производству моноклональных антител весьма высока, однако она компенсируется возможностью работы в обычном окружении и относительно несложными функциями операторов. [c.46]

Смотреть страницы где упоминается термин Моноклональные культуры: [c.17] [c.278] [c.281] [c.140] [c.187] [c.187] [c.216] [c.183] [c.183] [c.347] [c.534] [c.562] [c.332] [c.332] [c.226] [c.261] [c.7] [c.120] [c.99] [c.264] [c.39] [c.101] [c.102] [c.14]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология