Аминогексил-АМР-сефароза

Сефароза с гексаметилендиамином Аминогексил-сефароза 4В Сефароза Сефароза 4В [c.303]

Для получения аминогексил-сефарозы 10 мл сцеженного осадка активированной сефарозы 4Б промывали [c.220]

Рис. 3.4. Емкость сорбента с иммобилизованным нуклеотидом (№-(-6-аминогексил)-5 -АМР—сефароза) в зависимости от концентрации лиганда [4].

Сравнение связывающей способности различных ферментов -(5-аминогексил)-5 -АМР—сефарозой(1) и Р>-(6-аминогексил)-р2-(5 -аденозин)пирофосфат—сефарозой( 11) [c.60]

Существенное значение способа присоединения нуклеотидов к нерастворимому носителю для эффективности хроматографии зависимых от пиридиннуклеотида киназ и дегидрогеназ показано исследованиями Гарвея и др. [8]. Сорбент №-(6-аминогексил-)-АМР —сефароза содержит АМР, привязанную к сефарозе №-аде-ниновой частью. [c.73]

Рис. 5.7. Влияние распределения аффинного лиганда на емкость 1 -(6-аминогексил)-5 -АМР—сефарозы по лактатдегидрогеназе [6].

Рис. 5.11. Влияние температуры на емкость №-(6-аминогексил)-5 -АМР—сефарозы [91.

Рис. 6.4. Специфическое элюирование алкогольдегидрогеназы и фосфофруктокиназы с №-(6-аминогексил)-5 -АМР—сефарозы [7].

Иммобилизация авидина на аминогексил-сефарозе [c.277]

С, сливали и оставляли на холоду 1 ч. Реакцию продолжали 3 ч при комнатной температуре и слабом перемешивании. К реакционной смеси дс авляли осадок аминогексил-сефарозы, вносили 2 мл диметилформамида, чтобы сделать, суспензию более жид кой, и оставляли смесь на ночь при 18°С и перемешивании магнитной мешалкой. Затем 3 реакционной смеси отсасывали всю жидкость и осадок дважды промывали небольшими объемами диметилформамида, смесью равных объемов диоксана и, диметилформамида и большим количейтвом воды. Несвязавшийся пепстатин определяли по способности тормозить протеолитическую активность кристаллического пепсина. В данных условиях опыта с носителем связывалось около 15 мг пепстатина. [c.220]

Сравнивая связывание различных дегидрогеназ и киназ па N - (6-аминогексил) -5 -АМР—сефарозе и Р - (6-аминогексил) -Р -(5 -аденозин) пирофосфат—сефарозе, Харвей и др. [9] выразили силу взаимодействия между ферментом и иммобилизованным нуклеотидом с иомоплью так называемой связываемости . Этот параметр представляет собой концентрацию хлорида калия (мМоль/л) в центре пика фермента при элюировании фермента линейным градиентом концентрации КС1 (рис. 4.6 и табл. 4.2). Для определения константы диссоциации комплекса лактатдегидрогеназы с №-(6-аминогексил)-5 -АМР, связанным с сефарозой, Лоу и др. [11] использовали линейную зависимость между количеством связанного фермента и концентрацией иммобилизованного нуклеотида. [c.58]

Образец (100 мкл) сырого экстракта дрожжей наносился на колонку (50X5 мм), содержащую 0,5 г К -(6-аминогексил)-5 -АМР—сефарозу, предварительно уравновешенную 10 мМ (К.Н2Р044-К0Н) pH 7,5. После отмывки неадсорбированных белков ферменты элюировались в линейном градиенте концентрации (0—1 моль/л) КС1 (общий объем элюата 20 мл) скорость потока 8 мл/ч. В элюате обнаружены 1 — инертный белок 2 — глюкоза-6-фосфатде-гидрогеназа 3 — глутатионредуктаза 4 — малатдегидрогеназа и 5 — дрожжевая алкоголь- [c.59]

Другим примером влияния концентрации аффинного лиганда является аффинная хроматография смеси лактатдегидрогеназы и сывороточного альбумина на N -(6-аминогексил)-5 -АМР — сефарозе [8]. При высоких концентрациях лиганда (1,5 мкмоль 5 -АМР в 1 мл) для элюирования с )ермента необходимо введение NADH ( удар ). При низких концентрациях (0,125 мкмоль 5 -АМР в 1 мл) десорбция фермента достигается просто градиентом концентрации (от О до 1 моль/л) хлорида калия. Дальнейшее уменьшение количества прикрепленного лиганда (0,025 мкмоль 5 -АМР в 1 мл) приводит к прогрессивному увеличению доли лактатдегидрогеназы, элюируемой исходным уравновешивающим буфером даже перед наложением линейного градиента солей. В то же время [c.75]

Образец фермента (100 мкл), содержащий миокиназу (4 Е) и бычий сывороточный альбумин (1,5 мг), наносили на колонку (50X5 мм), содержащую 1 г Р -(6-аминогексил)-Р -(5 -аденозин)пирофосфат — сефарозу сорбент разбавлялся до требуемой концентрации лиганда немодифицированной сефарозой 4В. [c.78]

Изменения аффинности и емкости Р -(6-аминогексил)-Р -(5 -аденозин) пирофосфат — сефарозы при разбавлении разными количествами немодифицированной сефарозы на примере взаимодействия с миокиназой хорошо видны в табл. 5.2 [8]. Разбавление аффинным сорбентом ведет к уменьшению связываемости р, выраженной через концсптрацпн хлорида калия, которые необходимы для элюирования фермента. Емкость сорбента, выраженная в единицах активности фермента, сорбированного па 1 мкмоль нуклеотида, возрастает при низких концентрациях нуклеотида, хотя абсолютная емкость на 1 г материала колонки с разбавлением уменьшается. [c.78]

Зависимости связываемости р лактатдегидрогеназы от концен-трацпп лиганда в Ы -(6-аминогексил)-5 -АМР — сефарозе, разбавленной незамещенной сефарозой до требуемой концентрации лиганда, и от той же концентрации в сес арозе, равномерно модифицированной М -(6-аминогексил)-5 -АМР, близки [8]. Более сильная связываемость в случае сорбента, разбавленного незамещенной сефарозой, объяснена присутствием гранул геля, в которых концентрация лиганда остается идентичной той, которая была в исходном неразбавленном геле. В гелях, которые содержали равномерно распределенный лиганд, связываемость р лактатде- [c.78]

Если концентрация лиганда №-(6-аминогексил)-5 -АМР, иммобилизованного на сефарозе, и общее содержание лиганда постоянны, а меняется высота слоя геля при использовании разного диаметра колонок, связываемость р алкогольдегидрогеназы, а так- [c.79]

Рис. 5.8. Связываемость малатдегидрогеназы (1), лактатдегидрогеназы из мышцы сердца свиньи (2) и глицерокиназы (3) на N -(6-аминогексил)-5 -АМР—сефарозе в зависимости от концентрации аффинного лиганда [8].

Образец (100 мкл) фермента (5 Е) наносился на колонку (50X5 мм) с 0,5 г сефарозы 4В, содержащей различные концентрации присоединенного N -(6-аминогексил)-5 -АМР. [c.79]

В колоночной аффинной хроматографии достаточно сильное взаимодействие выделяемых веществ с иммобилизованным аффинным лигандом приводит к концентрированию вещества и его медленной миграции вниз по колонке. Этот процесс зависит от концентрации лиганда и почти не зависит от начальной концентрации свободных макромолекул. Например, в аффинной хроматографии глицерокиназы или лактатдегидрогеназы на К -(6-аминогексил)-5 -АМР— сефарозе не наблюдалось влияния концентрации фермента на емкость, если концентрации ферментов прямо пропорциональны концентрациям нуклеотида или зависимость между ними близка к таковой [21]. Необходимые при этом требования заключаются в том, что комплементарные макромолекулы следует наносить на колонку в ненасыщающих количествах, а также подбирать скорость потока раствора [19]. [c.82]

Поскольку взаимодействие макромолекул с иммобилизованным аффинантом — процесс, зависящий от времени, на него влияет скорость потока в колонке и время установления равновесия. Во многих случаях адсорбционное равновесие достигается очень медленно. Для взаимодействия макромолекул с иммобилизованным аффинантом недостаточно простых столкновений молекул, а необходимы также точная ориентация связывающих участков или их конформационная подстройка. В табл. 5.3 показано влияние времени уравновешивания на эффективность колонки с №-(6-аминогексил)-б -АМР — сефарозой [21]. Если глицерокииаза и лактатдегидрогеназа уравновешены с сорбентом, то обе величины, [c.82]

Образец (100 мкл), содержащий фермент (5 Е) и бычий сывороточный альбумин (1,5 мг), наносился и промывался на колонке (34X5 мм) с №-(б-аминогексил)-5 -АМ.Р — сефарозой (0,55 г влажного сорбента, содержащего 0,125 мкмоль/мл 5 -АМР). [c.83]

Ограниченная диффузия возникает, если молекулярная диффузия в порах матрицы затруднена из-за экранирования подхода макромолекул к прикрепленному аффинному лиганду. Экспериментально вклад этой диффузии можно определить с большим трудом, но для аффинной хроматографии на очень пористых носителях эти трудности становятся минимальными. На практике для достижения равновесных условий желательно, чтобы скорость потока была по возможности низкой. Например, при скорости потока 400 мл/ч для выделения стафилококковой нуклеазы на колонке объемом 20 мл небольшие количества нуклеазы появлялись в первом пике вместе с белковыми примесями, особенно если общая концентрация белков в образце была высока (20—30 мг/мл) [5]. Однако даже при такой высокой скорости потока нуклеаза полностью сорбировалась, если наносился менее концентрированный образец. Зависимость связывания лактатдегидрогеназы на №-(6-аминогексил)-5 -АМР — сефарозе от скорости потока пссле-дована Лоу и др. [21]. Было найдено, что увеличение скорости потока относительно мало влияет на сорбцию. При высоких скоростях потока эффективность колонки (ВЭТТ), а также связываемость р уменьшаются. Влияние скорости потока более заметно в небольших колонках, с которых часть белка с ферментативной активностью элюируется со свободным объемом. Влияния концентрации инертного белка (бычьего сывороточного альбумина) при высоких скоростях потока (67 мл/ч) также не обнаружено. [c.84]

Данные, приведенные на рис. 5.10, а, показывают влияние концентраций лактатдегидрогеназы и глицерокиназы на емкость Ы -(6-аминогексил-5 -АМР)—сефарозы в статических условиях [21]. Процент связанного фермента возрастает с ростом его концентрации, причем наиболее предпочтительны для работы концентрации 2 ед./мл. Хотя связываемости р лактатдегидрогеназы [c.85]

Фермент, разбавленный уравновешивающим буфером [10 мМ (КН2РО4+КОН), pH 7,5] до подходящей концентрации а), или 10 Е лактатдегидрогеназы, суспендированной в 100 мл уравновешивающего буфера (б), инкубировались с №-(б-аминогексил)-5 -АМР—сефарозой (0,5 г влажного препарата сорбента, 1,5 мкмоль/мл 5 -АМР) в смесителе Коултера при 4,5 °С. Через 30 мин (а) или определенные интервалы времени (б) инкубация приостанавливалась и после отстаивания сорбента (через 15 мин) удалялся супернатантный раствор. При пятиминутных периодах инкубации сорбент отмывался тремя порциями по 5 мл уравновешивающего буфера, затем вновь суспендировался с 2,5 мл уравновешивающего буфера и переносился в колонку (50X5 мм). Для элюирования через колонку пропускалось 11,0 мл уравновешивающего буфера, содержащего линейный градиент концентрации (0—1,0 моль/л) K l (общий объем элюата 20 мл). Ферменты определялись в промывках и элюатах колонки. [c.85]

Влияние времени инкубации (уравновешивания) на емкость N -(6-аминогексил)-5 -АМР — сефарозы при связывании лактатдегидрогеназы в статических условиях [21] показано на рис. 5.10,6. Связываемость фермента иммобилизованным нуклеотидом наиболее круто растет вначале, затем кривая становится более пологой 100% фермента связывается через 16 ч, а 50%-ное связывание достигается за 20 мин. Данные сорбции химотрипсина на КНг-сфе-роне с присоединенными карбобензокси-о-фенилаланином приведены на рис. 3.1 они указывают, что равновесие достигается быстрее. На рис. 10.4 показано, как на достижение равновесия влияет разбавление. [c.85]

Образец (100 мкл), содержащий 5 Е фермента и 1,5 мг бычьего сывороточного альбумина, наносился на колонку (50X5 мм) с 0,5 г N -(6-аминогексил)-5 -АМР—сефарозой. Методику см. в подписи к рис. 4.6. Емкость определялась по проценту ферментативной активности, задерживаемой сорбентом. Бычий сывороточный альбумин обнаружен в свободном объеме колонки. Концентрация иммобилизованного лиганда для дрожжевой алкогольдегидрогеназы составляла 1,5 мкмоль/мл АМР ), для глицерокиназы 1,5 мкмоль/л АМР (2) и 4,0 мкмоль мл [c.87]

Связывание лактатдегидрогеназы на №-(6-аминогексил)-б -АМР — сефарозе настолько сильно, что фермент нельзя элюировать даже 1 М КС1 при 40 °С. Однако для элюирования можно использовать линейный градиент концентрации NADH. На рис. 5.12 показан график зависимости концентрации NADH, необходимой для элюирования лактатдегидрогеназы, от температуры. С повышением температуры необходимая концентрация специфического элюирующего агента уменьшается, что отражается линейным графиком Аррениуса. Соответствующая энергия адсорбции составляет 54,6 кДж/моль (13,0 ккал/моль) [9]. [c.87]

На рис. 5.13 показано влияние температуры на связываемость р ферментов термофильного микроорганизма —- алкогольдегидрогеназы и фосфофруктокиназы из ВассШиз stearothermophilus — на №-(6-аминогексил)-5 -АМР —сефарозе [2]. Для упомянутых ферментов термофила связываемость р, напротив, первоначально [c.88]

Образец (100 мкл), содержащий 5 Е фермента и 1.5 мг бычьего сывороточного альбумина, наносился на колонку (50X5 мм) с 0,5 г Ы -(б-аминогексил)-5 -АМР—сефарозой (1,5 мкмоль/мл АМР), а — методику см, в подписи к рис. 4.6 элюирование осуществлялось в линейном градиенте концентрации (0—5 ммоль/л) NADH (общий объем элюата 20 мл) б — график [c.88]

Рис. 5.13. Влияние температуры на связываемость р алкогольдегидрогеназы 1) и фосфофруктокиназы 2) на N -(6-аминогексил)-5 -АМР—сефарозе [2]. Проводился диализ экстракта фермента (0,5 мл), содержащего 81 Е фосфофруктокиназы, 20 Е или 18,7 мг/мл алкогольдегидрогеназы, против 10 мМ К-фосфатиого буферного раствора (pH 6,8) затем раствор пропускался через колонку с замещенной АМР—сефарозой. Элюирование осуществлялось в линейном градиенте концентрации (0—1 моль/л) КС1 (общий объем элюата 40 мл) в 10 мМ К-фосфатном буфере скорость потока 0,4 мл/мин.

Рис. 5.14. Зависимость связываемости 3 алкогольдегидрогеназы (а) и фосфофруктокиназы (б) на №-(6-аминогексил)-5 -АМР—сефарозе от pH и связь кажущихся р/С (абсцисса в точках перегиба на рис, а и б) и температур связывания алкогольдегидрогеназы 1) и фосфофруктокиназы (2) (в) [2]. Условия см. в подписи к рис. 5.13 10 мМ трис-фосфат доводился до требуемого pH при соответствующей температуре.

Рис. 5.15. Влияние pH на связывание лактатдегидрогеназы мышцы сердца свиньи 8-аминогексаноил-ЫАО+—сефарозой (а) и N -(6-аминогексил)-АМР — сефарозой

В работе Лоу и др. [42] сопоставлены свойства сорбентов на основе целлюлозы и сефарозы, для чего использовались экспериментальные кривые титрования 6-аминогексил-МАО+—сефарозы, немодифицированной сефарозы, 6-аминогексаноил — сефарозы и соответствующих производных целлюлозы (рис. 8.1). Очевидно образование ионизирующих групп после активации бромцианом это было также показано в случае целлюлозы, когда для реакции присоединения использовали дициклогеисилкарбодиимид [38]. Отклонение, наблюдаемое для сефарозы, существенно меньше, [c.180]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология