Сефароза связывание температуры

По-видимому, именно гидрофобности 28S РНК можно приписать и тот факт, что 60S субъединицы рибосом значительно легче связываются с сефарозой 4В, чем 40S субъединицы. При концентрации 0,3 М КС1 и температуре 4° 60S субъединицы задерживаются сефарозой на 90%, а связывание 40S субъединиц достигает 60% лишь в [c.179]

Аминогексил- или 6-аминогексаноатсефарозу связывают с лигандом карбодиимидным методом. Высущенный материал взвешивают и погружают для набухания в раствор 0,5 М Na l (1 г = 4 мл геля). Предназначенный для связывания лиганд (белок или низкомолекулярное вещество) растворяют в воде или водном растворителе и доводят pH до 4,5. К сефарозе добавляют такой объем водного раствора гидрохлорида 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида, чтобы получилось 10 мг набухшего геля на 1 мл. Гель и карбодиимид перемешивают в течение ночи при комнатной температуре (нельзя использовать магнитную мешалку). Избыток реактивов удаляют промыванием той же смесью воды и растворителя, которая будет использована на последующем этапе связывания лиганда. Полученный конъюгат можно хранить при 4—8°С. Предназначенный для связывания лиганд растворяют в воде или смеси воды и растворителя, доводя pH водной фазы до 4,5, при этом никакого буфера не используют. Величину pH, которая снижается, главным образом в начале реакции, поддерживают на уровне 4,5, добавляя NaOH. Связанный с лигандом гель тщательно промывают связывающим раствором нет необходимости блокировать избыточные группы. После промывки в дистиллированной воде, а затем в буфере гель готов для использования в аффинной хроматографии. Материал можно хранить при pH 7,0 и температуре ниже 8°С без замораживания. [c.219]

Суммарную ядерную РНК растворяли в 0,5—1 мл 0,01 М Na-ацетатного буфера (pH 6), содержащего 0,5% ДДС-Na, и прогревали 5 мин при 100° для разрушения агрегатов и диссоциации возможных двунитевых структур РНК и остаточных РНК—ДНК-гибридов. Затем раствор вносили на термостатированную при 50° колонку тиопропил-сефарозы 6В размером 5 х 1 см, уравновешенную тем же раствором, и выдерживали при этой температуре 30 мин. Повышенная температура (но не выше 50° ) увеличивает эффективность связывания на сорбенте новосинтезированной меркурированной РНК. Затем температуру снижали до 20° и промывали колонку последовательно избытком того же буфера, водой, 50%-ным водным раствором диметилсульфоксида (ДМСО) и снова водой. Отмечено, что промывка ДМСО существенно улучшала избирательность связывания Hg-PHK. Элюцию последней вели 50 мМ раствором -меркаптоэтанола в 0,01 М Na-ацетатном буфере (pH 6). Для отбора фракций, содержащих РНК, ее в ходе синтеза одновременно с меркурированием метили тритием с помощью H-UTP. [c.437]

Связывание лактатдегидрогеназы на №-(6-аминогексил)-б -АМР — сефарозе настолько сильно, что фермент нельзя элюировать даже 1 М КС1 при 40 °С. Однако для элюирования можно использовать линейный градиент концентрации NADH. На рис. 5.12 показан график зависимости концентрации NADH, необходимой для элюирования лактатдегидрогеназы, от температуры. С повышением температуры необходимая концентрация специфического элюирующего агента уменьшается, что отражается линейным графиком Аррениуса. Соответствующая энергия адсорбции составляет 54,6 кДж/моль (13,0 ккал/моль) [9]. [c.87]

Рис. 5.14. Зависимость связываемости 3 алкогольдегидрогеназы (а) и фосфофруктокиназы (б) на №-(6-аминогексил)-5 -АМР—сефарозе от pH и связь кажущихся р/С (абсцисса в точках перегиба на рис, а и б) и температур связывания алкогольдегидрогеназы 1) и фосфофруктокиназы (2) (в) [2]. Условия см. в подписи к рис. 5.13 10 мМ трис-фосфат доводился до требуемого pH при соответствующей температуре.

Для хроматографии рибосомальной РНК и для выделения плазминогена ]1роизводится лизин—сефароза 4В путем связывания ь-лизина с сефарозой 4В после активации бромцианом. Концентрация связанного лизина составляет 4—5 мкмоль на 1 мл набухшего геля. Лизин—сефароза 4В поставляется в виде лио-филизованного норощка пакетах по 15 г, что эквивалентно 60 мл набухшего геля. Порошок содержит добавки для сохранения способности геля к набуханию. При хранении сухого геля при температурах <8°С не наблюдается никакой заметной потери связанного лиганда даже через 1 год хранения. [c.141]

Ряд алкилагароз со структурой СНз(СН2)пМН—сефароза (где п принимает значения от О до 7), и-аминоалкилагароз со структурой ЫН2(СН2)п ЫН—сефароза (где п — от 2 до 8) характеризуется близким содержанием алкильных боковых цепей на гранулу геля [15, 49]. В одинаковых условиях (pH, ионная сила, состав буферного раствора и температура) способность СНз(СН2)пЫН—сефарозы удерживать фосфорилазу Ь зависит от длины углеводородных цепей. При хроматографии на производных сефарозы (я = 0 или 1) фосфорилаза Ь выходила из колонки с фронтом растворителя при п = 2 происходила задержка фермента, а при п = 3 фермент адсорбировался. Элюирование фосфорилазы Ь с модифицированной сефарозы (п = 3) возможно с помощью деформирующих буферных растворов, которые, как было показано, приводят к обратимым структурным изменениям фермента. На производном сефарозы с л = 5 связывание фосфорилазы было настолько сильным, что фермент не элюировался с колонки, даже когда pH деформирующего буферного раствора понижался до 5,8, хотя деформирующая способность такого буфера намного выше. Освободить фосфорилазу Ь из комплекса с этим производным можно только в неактивной форме после промывки колонки 0,2 М уксусной кислотой. Сама агароза содержит отрицательные заряды, а связывание алкил- или ариламинов на активированной бромцианом агарозе вводит в гель положительные заряды (разд. 8.2.4). В связи с этим йост и др. [28] обращали внимание на то, что на сефарозе с алкиламинами, прикрепленными после предварительной активации носителя бромцианом, связывание белков происходит большей частью при pH выше изоэлектрической точки выделяемых белков. Поэтому допускалось, что в этих случаях электростатические взаимодействия с положительно заряженной Ы-замещенной изомочевиной более существенны для связывания, чем гидрофобные взаимодействия с гидрофобной боковой цепью. Тем не менее гранулы агарозы не связывают фосфорилазу Ь, пока к ним не будут прикреплены алкильные боковые цепи некоторой минимальной длины. Кроме того, отмеченные выше заряды в равной мере присутствуют во всех членах гомологического ряда, и, следовательно, они не могут быть причиной различий в степени [c.152]

Рис. 5. Аффинная хроматография с конкурентным зональным элюированием для системы с бивалентным связыванием. Зоны (100 мкл) мономера [ ]IgA (бивалентное связывание) наносми на фосфорилхолин-сефарозу с высокой плотностью лиганда (7X25 мм, [Ь]=5-10-5 моль/л), уравновешенную МаСЬ натрийфосфатным буфером (содержащим 1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина) фосфорилхолин имел следующие концентрации (моль/л) 7 — 0 2—1 10- 5 —2,5-10-6 4 — 5,010- 5 — 7,5-10- 5—1,0-10-5. Элюирование осуществляли при комнатной температуре буфером, содержащим указанное количество растворенного конкурентного фосфорилхолина. В правом верхнем углу по данным элюирования построена зависимость 1/(К—Уо) от концентрации фосфорилхолина. Константы диссоциации /Сь и /Сп рассчитаны с помощью этого графика с использованием уравнения (5) и приведены в табл. I [9].

Требуемое количество геля замачивают для набухания в 10 М соляной кислоте 10 М соляную кислоту используют также для промывки геля в течение 15 мин. 1 г лиофильно высушенного геля набухает до объема 3,5 мл. Гель рекомендуется промывать в несколько приемов, используя на 1 г сухого геля 200 мл раствора. Сразу же после промывки добавляют раствор аффинного лиганда, который необходимо привязать к сефарозе. Оптимальные условия для связывания аффинного лнганда (pH, состав буфера и температура) зависят до определенной степени от характера лиганда. Как правило, реакция связывания наиболее эффективна при pH 8—10, но можно использовать и более низкие значения pH, если этого требует природа связываемого лигапда. Аффинный лиганд присоединяется в достаточных количествах даже и при этих pH, если увеличить количество бро.мциана при активации и количество лиганда при связывании. Аффинный ли1анд, в особенности белкового характера, растворяют в буфере с высокой ионной силой (около 0,5) для предотвращения неспецифической адсорбции. Высокая ионная сила облегчает затем последующую промывку.. Можно использовать карбонатный и боратный буферы с добавка.ми хлорида натрия. [c.190]

Когда связывание аффинного лиганда на нерастворимом носителе закончено, рекомендуется удалить остающиеся активные группы, чтобы исключить дальнейшее связывание. Если аффинный лиганд связывается своими аминогруппами, в качестве инактивирующих агентов наиболее часто используются низкомолекулярные первичные амины. Например, согласно рекомендациям фирмы РЬагтас1а, при связывании на сефарозе, активированной бромцианом, инактивация остающихся активных групп может быть достигнута достаточно просто при взаимодействии с 1 М 2-ами-но этанолом при pH 9 и комнатной температуре в течение 2 ч, в то же время после связывания на эпоксиактивированной сефарозе для инактивации в тех же условиях требуется 4 ч. Используется тот же буфер, что и при связывании, например 0,1 М. бикарбонат натрия, содержащий 0,5 моль/л хлорида натрия. Для бло- [c.216]

Отмытую И декантированную сефарозу суспендируют в дистиллированной воде (1 1). Работу ведут под тягой. В суспензию сефарозы погружают электроды рН-метра и при постоянном перемешивании прибавляют к ней небольшими порциями бромциан (50—300 мг на 1 мл набухшей сефарозы). Добавляя раствор гидроксида натрия, pH суспензии поддерживают примерно около И. Для 5—10 мл сефарозы и 1—3 г бромциана рекомендуется 2М раствор гидроксида натрия, для 100—200 мл сефарозы и 20—30 г бромциана — 8М его раствор. Температура должна быть равна примерно 20 °С если необходимо охлаждение, добавляют лед. Реакция заканчивается через 8—12 мин. Далее Куатреказас рекомендует добавить большое количества льда и быстро перенести суспензию в воронку Бюхнера. Активированную сефарозу промывают при постоянном отсасывани предварительно охлажденным буферным раствором того же состава, который используют при последующем связывании аффинного лиганда. Объем буферного раствора, расходуемый на промывку сефарозы, должен в 10—15 раз превышать объем раствора, в котором проводилась активация сефарозы. Промытую сефарозу как можно быстрее суспендируют в равном объеме раствора аффинного лиганда. Связывание ведут при постоянном перемешивании при пониженной температуре (4°С) в течение 16—20 ч. Согласно данным Куатреказаса [14], промывка, добавление раствора аффинного лиганда и смешивание не должны длиться более 90 с. Даже при пониженной температуре активированная сефароза неустойчива. Связывание аффинного лиганда с активированной бромцианом сефарозой более подробно рассматривается в лоследующих разделах. [c.17]

Оптимальные условия связывания, pH, состав буферного раствора и температура, в значительной степени зависят от характера аффинного лиганда. Наиболее эффективно реакция проходит при pH 8—10, однако, если этого требует природа аффинного лиганда, можно использовать и более низкие значения pH. Аффинный лиганд, особенно белковой природы, растворяют в буфере с высокой ионной силой (около 0,5), чтобы предотвратить неспецифическую сорбцию, например белка на белке, которая обусловлена полиэлектролитной природой белков. Для последующей отмывки сорбента используются растворы с более высокой ионной силой. Можно применять карбонатные или бо- ратные буферы с добавкой хлорида натрия. Количество присоединенного лиганда зависит от соотношения в реакционной смеси аффинного лиганда и объема геля, pH, природы самого лиганда (числа реакционноспособных групп и т. д.), а также от длительности проведения реакции и температуры. Например, при иммобилизации химотрипсина к 2 мл NBr-акти Вированной сефарозы при pH 8 присоединяется только 5 мг из 10 мг взятого белка, из 20 мг белка связывается примерно 8 мг, а из 30 мг — примерно 10 мг. При комнатной температуре (20— 25 °С) связывание обычно завершается за 2 ч, при пониженной температуре рекомендуется увеличить длительность реакции до 16 ч, т. е. оставлять реакционную смесь на ночь. В процессе связывания реакционную массу необходимо перемешивать, но применять магнитную мешалку не рекомендуется, так как при таком перемешивании можно разрушить гель. Лучше всего перемешивать реакционную смесь встряхиванием. Когда реакция закончится, гель переносят на пористый стеклянный фильтр и промывают тем же буферным раствором, в котором проводилось связывание. Оставшиеся активные группы рекомендуется блокировать, с этой целью гель обрабатывают 2 ч 1М этанола-мином при pH 8. Конечный продукт следует промыть 4—5 раз буферным раствором с высоким или низким pH. Например, можно использовать ацетатный (0,1 М, pH 4) или боратный буферный (0,1 М, pH 8,5) раствор, содержащий 1 моль/л хлорида натрия. Как уже упоминалось во введении, все нековалентно связанные соединения следует отмыть. [c.20]

Тщательно промойте колонку 0,1 М боратным буфером, pH 9,0, и ресупен-дируите гранулы сефарозы в том же буфере при комнатной температуре. Оставьте аликвоту для проверки степени связывания иммуноглобулина с гранулами сефарозы (с 1 мл сефарозы должно связываться 0,5—2 мг иммуноглобулинов), [c.203]

Изучение влияния pH и температуры проведено на адсорбентах, специфичных к группе ферментов 10, 11]. Влияние pH на связывание лактатдегидрогеназы из сердечной мышцы с двумя аффинными адсорбентами представлено на рис. 6. Взаимодействие фермента с обоими адсорбентами явно не зависит от концентрации ионов водорода в растворе вплоть до pH 8, но в более щелочной области наблюдалась зависимость от природы адсорбента. В случае б-аминогексаноил-ЫАО+-сефа-розы поведение фермента характеризовалось кажущейся константой рК 8,5, в то время как для Ы -(6-аминогексил)-5 -АМР-сефарозы р/С 9,7. Различия между значениями кажущихся констант рК, определенных для двух иммобилизованных [c.109]

Рис. 7. Влияние температуры на связывание дрожжевой алкогольдегидрогеназы и глицерокиназы с Ы -(б-аминогексил)-5-АМР-сефарозой. Концентрация АМР (мкмоль/л) / и 2—1,5 3 — 4,0 [И]. (Воспроизведено с разрешения.)

Рис. 8. Влияние температуры на связывание лактатдегидрогеназы с К -(6-амнногексил)-5 -АМР>сефарозой [11]. (Воспроизведено с разрешения.)

Справочник химика 21

Химия и химическая технология