Аллантоисная жидкость

Постановка РГА. После вскрытия куриного эмбриона аллантоисную жидкость отсасывают и разливают в пробирки или лунки плексигласовой пластины в объеме 0,5 мл (для контроля берут 0,5 мл такой же жидкости незараженного эмбриона). Затем добавляют по 0,2 мл 1% суспензии отмытых куриных эритроцитов и выдерживают при комнатной температуре. Результаты реакции учитывают через 40 мин после оседания эритроцитов I I I I выраженная гемагглютинация — тонкая [c.62]

Получить зараженную аллантоисную жидкость, содержащую [c.202]

Обнаружение вируса в куриных эмбрионах. Зараженные эмбрионы выдерживают в термостате при 35 — 37 °С в течение 48 — 72 ч в зависимости от вида изучаемого вируса. Затем яйца охлаждают при 4 °С в течение 18 ч для максимального сужения кровеносных сосудов эмбриона и асептически вскрывают. Амниотическую и аллантоисную жидкость отсасывают шприцем, оболочки и эмбрион извлекают в стерильные чашки Петри. [c.268]

Аллантоисная жидкость Воздушный мешок [c.263]

Выделить эритроциты из 17-дневного оплодотворенного куриного яйца. Для этого удалить скорлупу над воздушным мешком, разрезать кровеносные сосуды в оболочке и дать крови излиться в аллантоисную жидкость. Удалить жидкость и промыть клетки МСИ без сыворотки (0,5 мл). [c.192]

Собрать аллантоисную жидкость и центрифугировать при 400 g в течение 10 мин. [c.203]

Перед сбором вируса скорлупу над воздушным пузырем разламывают и удаляют. Проколов обнаженную мембрану и отодвинув эмбрион в сторону с помощью стерильного пинцета, стерильной пастеровской пипеткой (с коротким капилляром и желательно с широким отверстием) отсасывают аллантоисную жидкость. В среднем получают около 10 мл жидкости из одного яйца со значительными индивидуальными колебаниями. Нужно [c.398]

Аллантоисную жидкость осветляют центрифугированием 10 мин при 10 000 и хранят супернатант при 4 или —70°С (о хранении вируса см. разд. 6). [c.166]

Амниотическую жидкость осветляют и хранят так же, как и аллантоисную жидкость. [c.166]

Для культивирования вирусов удобно использовать монослойные культуры клеток, выращиваемые в пластиковых чашках или флаконах лучшие результаты получают при заражении плотного монослоя. Сыворотка крови, входящая в состав культуральных сред, содержит вещества, снижающие инфекционность вируса. Поэтому перед внесением инокулята вируса, который обычно представляет собой аллантоисную жидкость, разведенную PBS для обеспечения необходимой множественности инфекции, с монослоя сливают среду и промывают его PBS. Адсорбцию вируса на монослое проводят при комнатной [c.167]

Для подавления бактериальной флоры исследуемый материал обрабатывают антибиотиками (500— 1000 ЕД/мл пенициллина и 200 ЕД/мл стрептомицина) и вводят по 0,2 мл его 10—11-дневным куриным эмбрионам в полость амниона и аллантоиса (см. подразд. 3.1.3). Материалом одной пробы заражают не менее пяти эмбрионов, которые инкубируют в течение 3 — 4 дней при 37 °С. После инкубации эмбрионы охлаждают в течение 2 —4 ч при 4 °С. Аллантоисную жидкость отсасывают шприцем или пастеровской пипеткой, амниотическую — шприцем с короткой иглой. Накопление вируса в куриных эмбрионах обнаруживают с помощью РГА, для чего аллантоисную и амниотическую жидкости серийно разводят и добавляют 1%-ю суспензию куриных эритроцитов. Инфекционным материалом можно также заражать культуры клеток почек обезьян, эмбриона человека и другие, используя питательные среды без сыворотки. Однако эти методы употребляются реже, чем заражение куриных эмбрионов. Вирус выявляют с помощью РИФ, а также по ЦПД, РГадс с 0,4%-й суспензией эритроцитов морской свинки. [c.280]

По аналогии с бактериальными вакцинами вирусные также подразделяют на живые и инактивированные. Для приготовления обоих типов вирусных вакцин необходимо накопить вирусный материал (вирионы), используя либо куриные эмбрионы, либо культуры тканей из почек обезьян, куриного эмбриона, диплоидных клеток человека. Так вакцинный вирус гриппа (авирулентный) накапливают в аллантоисной жидкости эмбриона, которую затем отсасывают и центрифугируют. Если предполагают готовить живую вакцину, то вирус суспендируют и разводят до нужной концентрации и подвергают лиофильному высушиванию. [c.485]

Разработаны многочисленные методы очистки вирусов гриппа из аллантоисной жидкости или из культуральной среды. Выбор конкретного метода определяется требуемой степенью чистоты. Чистоту полученного вируса можно установить с помощью электрофореза вирионных белков в полиакриламидном геле (рис. 6.5), но, как и в случае всех оболочечных вирусов, почкующихся через плазматическую мембрану, даже при самой тщательной очистке невозможно избежать контаминации вируса клеточными белками. Кроме того, вирус может быть плео-морфным, что осложняет его очистку центрифугированием в градиентах плотности. Тем не менее при работе с вирусами, дающими высокий титр в культуре клеток или куриных эмбрионах, удается получить препараты, степень контаминации которых клеточными белками незначительна. На первой стадии очистки из содержащей вирус аллантоисной жидкости или культуральной среды удаляют клеточный дебрис с помощью низкоскоростного центрифугирования (10 мин при 2000—10 000 д). Все стадии следует проводить при 0°С, чтобы свести к минимуму потери инфекционности и протеолиз вирионных белков. [c.181]

Технология получения гемагглютинина из гриппозных вирионов заключается в следующем накопленный вирусный материал в аллантоисной жидкости куриного эмбриона сепарируют, подвергают микрофильтрации и фильтрационному концентрированию примерно в 50 раз, при необходимости дополнительно очищают ультрацентрифугированием в градиенте плотности сахарозы концентрированный вирионный материал обрабатывают катионным ПАВ и отделяют гемагглютинины ультрафильтрацией с последующими диализом и стерилизующей фильтрацией. На последней стадии стандартизируют и контролируют с ъединичную вакцину (особенно — на отсутствие живых гриппозных вирусов). [c.486]

Чаще всего суспензию вирусного материала вводят в аллантоисную полость или, реже, на хорионаллантоисную оболочку в количестве 0,05-0,1 мл, прокалывая продезинфицированную скорлупу (например, иодированным этанолом) на расчетную глубину. После этого отверстие закрывают расплавленным парафином и эмбрионы помещают в термостат, в котором померживается оптимальная температура для репродукции вируса, например 36-37,5°С. Продолжительность инкубации зависит от типа и активности вируса. Обычно через 2-4 суток можно наблюдать изменение оболочек с последующей гибелью эмбрионов. Зараженные эмбрионы контролируют ежедневно 1-2 раза (овоскопируют, поворачивают другой стороной). Погибшие эмбрионы затем передают в отделение сбора вирусного материала. Там их дезинфицируют, аллантоисную жидкость с вирусом отсасывают и переносят в стерильные емкости. Инактивацию вирусов при определенной температуре проводят обычно с помощью формалина, фенола или других веществ. Применяя высокоскоростное центрифугирование [c.545]

На куриных эмбрионах получают, например, живую противогриппозную вакцину. Она предназначается для интраназального введения (лицам старше 16 лет и детям от 3 до 15 лет). Вакцина представляет собой высушенн5гю аллантоисную жидкость, взятую от зараженных вирусом куриных эмбрионов. Тип вируса подбирают согласно эпидемиологической ситуации и прогнозам. Поэтому препараты могут выпускаться в виде моновакцины или дивакцины (напрмер, включающая вирусы А2 и В) в ампулах с 20 й 8 прививочными дозами для соответствующих групп населения. Высушенная масса в ампулах обычно имеет светло-желтый цвет, который сохраняется и после растворения содержимого ампулы в прокипяченой остуженной воде. [c.546]

Штаммы вируса гриппа и парагриппа размножали в 10—11-дневных куриных эмбрионах при 35° после заражения их соответствующим вирусом в аллантоисную полость при разведении вируса 1 1000. Затем эмбрионы охлаждали при 4° в течение 12 час. и собирали аллантоисную жидкость, содержащую вирус. Вирусы аллантоисной жидкости концентрировали и очищали сначала адсорбцией на хорошо отмытых формалинизированных куриных эритроцитах с последующей элюцией физиологическим раствором хлористого натрия, а потом дифференциальным центрифугированием, после чего осадок вирусов суспендировали и хроматографировали на колонке с сефадексом Г-75. [c.77]

Вскрытие зараженных эмбрионов производят в сроки максимального накопления вируса (через 48—72 ч инкубации при 37°С). После обработки спиртом и 2% йодной настойкой скорлупу рассекают ножницами немног ) выше очерченной карандашом границы воздушной камеры, наклоняя яйцо так, чтобы избежать попадания скорлупы в полость (рис. 35). Скорлупу отбрасывают, осторожно снимают ее оболочку и рассматривают хорион-аллантоисную оболочку вокруг места заражения, отмечая наличие или отсутствие очагов поражения-геморрагий, белесоватых очагов (рис. 36). Затем пастеровской пипеткой прокалывают хорион-аллантоисную оболочку в участке, свободном от сосудов, и отсасывают аллантоисную жидкость. После этого извлекают хорион-аллан-тоисную оболочку, которую дважды промывают изотоническим раствором хлорида натрия, помещают в чашку Петри и отмечают на черном фоне наличие специфических поражений. [c.62]

Исследовать полученную из зараженных куриных эмбрионов амниотическую и аллантоисную жидкость на присутствие вируса гриппа в реакции гемаг-глютинацив. [c.233]

Живая 1риппозная вакцина. Готовится из аллантоисной жидкости куриных эмбрионов, зараженных вакцинными штаммами вируса гриппа основных серотипов, вакцину одного вида вводят через нос, другую — через рот. [c.239]

В образцах аллантоисной жидкости перед их объединением и инактивацией титруют содержание вируса, используя реакцию гемагглютинации. [c.399]

В среднем выход вируса Сендай в аллантоисной жидкости равен около 1800 ГАЕ/мл, или 3,25 + 0,20 логарифмических единиц. [c.400]

Вирус обычно вводят в заполненную жидкостью аллантоисную полость яйца (рис. 6.1), откуда он может проникнуть в хорионаллантоисную оболочку и заразить образующие ее клетки. Вирусное потомство выходит в аллантоисную жидкость и может быть легко извлечено из яйца путем отсасывания этой жидкости. Некоторые штаммы, в частности новые природные изоляты, а также вирусы типа С плохо размножаются на хорио-наллантоисной оболочке, но размножаются при введении непосредственно в амниотическую полость при этом вирус получает доступ к разнообразным тканям эмбриона, и образующееся потомство выходит в амниотическую жидкость, которую можно извлечь отдельно. [c.162]

I. Сбор аллантоисной жидкости [c.165]

Эмбрион и желточный мешок осторожно отодвигают пинцетом и отсасывают аллантоисную жидкость пипеткой с широким концом. Из яйца среднего размера получают 7—10 мл бледно-желтой жидкости. Примесь желтка в аллантоисной жидкости мешает дальнейшей очистке вируса, поэтому при ее отборе следует избегать повреждения желточного мешка. Если вирус предназначен для биохимических исследований, например для анализа активности вирионных ферментов, аллантоисную жидкость следует собирать при О °С. [c.166]

Интенсивность размножения вируса в эмбрионах зависит от конкретного штамма. Дикие штаммы первоначально дают очень низкие титры (около 100 ГАЕ в 1 мл амниотической жидкости), но после нескольких пассажей на эмбрионах титр значительно возрастает. Для разных лабораторных штаммов, адаптированных к размножению на эмбрионах, выход также существенно варьирует, но в большинстве случаев в аллантоисной жидкости накапливается 2000—5000, а иногда и до 20000 ГАЕ/мл вируса. Очевидно, что адаптация к размножению в эмбрионах связана с селекцией генетических вариантов, поэтому следует иметь в виду, что результаты детального генетического и биохимического исследования штаммов, пассированных на эмбрионах, не обязательно характеризуют исходный изолят. [c.166]

Из каждого яйца отбирают аллантоисную жидкость и проводят реакцию гемагглютинации. При этом нет необходимости для каждого образца аллантоисной жидкости готовить последовательные разведения. В этом случае достаточно определить, размножался ли вирус в данном эмбрионе или нет. Для этого 25 мкл исследуемого образца разводят в 0,25 мл физиологического раствора в лунке планшета или в пробирке и добавляют [c.175]

Поскольку вирус гриппа обычно содержится в большом объеме аллантоисной жидкости или культуральной среды, перед очисткой его необходимо сконцентрировать. Существуют различные методы концентрирования вирусов, и выбор одного из них определяется оснащенностью лаборатории. [c.183]

Осаждение ПЭГ широко используется для получения вируса из аллантоисной жидкости и культуральной среды при отсутствии подходящего ротора для ультрацентрифугирования. Сухой ПЭГ 6000 добавляют к содержащей вирус жидкости до конечной концентрации 8% (вес на объем) и перемешивают суспензию 1 ч при 0° или 4°С. Затем вирус осаждают центрифугированием 20 мин при 10 000 g и ресуспендируют в небольшом объеме NTE. Ресуспендирование [c.183]

Вирус можно сконцентрировать из осветленной аллантоисной жидкости или культуральной среды, добавляя формалинизиро-ванные эритроциты до конечной концентрации 5% (объем на объем). Суспензию, содержащую эритроциты и вирус, инкубируют 1 ч при 4 °С при осторожном перемешивании. После этого эритроциты с адсорбированным на них вирусом осаждают центрифугированием 10 мин при 2000 g и 2 раза промывают осадок охлажденным до 0°С физиологическим раствором. Эффективность адсорбции можно проконтролировать в реакции гемагглютинации с содержащей вирус жидкостью до и после адсорбции иа эритроцитах. Если эффективность адсорбции ниже 90%, процедуру можно повторить с новой порцией эритроцитов. Адсорбированный вирус элюируют с эритроцитов, перемешивая суспензию в 10 мл физиологического раствора 30 мин при 37 °С. Затем эритроциты удаляют центрифугированием 10 мин при 2000 g и собирают супернатант, содержащий вирус. Эффективность элюции зависит от активности вирусной нейраминидазы, отщепляющей остатки сиаловой кислоты от клеточных рецепторов, что приводит к высвобождению вируса. Супернатант разводят NTE по крайней мере в 6 раз, вирус осаждают центрифугированием 30 мин при 200 000 g и 4°С, а затем ресуспендируют в подходящем буфере для хранения. [c.187]

Готовят ряд центрифужных пробирок, содержащих по 20 мкл содержащей вирус аллантоисной жидкости (примерно 1000 ГАЕ/мл) и 400 мкл 1%-ной суспензии эритроцитов. Вместо аллантоисной жидкости можно использовать очищенный вирус. Пробирки инкубируют 30 мин при О С за это время происходит связывание вируса с эритроцитами. [c.192]

При постановке реакции следует ступенчато варьировать pH по 0,2 единицы и для каждого значения pH ставить по 2 параллельные пробы следует определить и уровень гемолиза в отсутствие вируса, используя в качестве контроля незараженную аллантоисную жидкость. Для постановки данной реакции можно использовать эритроциты человека (тип (0,Rh—) или морской свинки, но не курицы. Удобно ставить реакцию в пробирках для микроцентрифуги. Выбор буферного раствора определяется тем, в какой области pH проводится реакция (однако буфер должен поддерживать pH в пределах 5,2—6,2). Наиболее удобны 2-(п-морфилино)этансульфоновая кислота (MES) и ее соль. [c.193]

Исходный изолят наращивают в оплодотворенных куриных эмбрионах, получая первичную заготовку ( первый эмбриональный пассаж ) в виде аллантоисной жидкости. Эту первичную заготовку рекомендуется разделить на небольшие порции и хранить в разных холодильниках на случай повреждения одного из них. [c.194]

Первой группе эмбрионов 9—10-суточного возраста материал вводят по 0.25 мл в аллантоисную полость. Эмбрионы инкубируют при 37°С 1°С в течение 5—6 сут. По истечении указанного срока аллантоисную жидкость собирают индивидуально от каждого эмбриона и проверяют в реакции гемагглютинации с эритроцитами морской свинки и петуха. При этом в лунках агглютинационных планшетов готовят 3—4 последовательных разведения (0.85 %-ным раствором Ыа) аллантоисной жидкости из каждого инокулирован-ного эмбриона. Затем в лунки добавляют равные объемы 0.5 %-ной взвеси эритроцитов (на 0.85 %-ном растворе Ыа). После 30—40 мин инкубации при 20—25 °С (после оседания эритроцитов в контрольных лунках) учитывают результаты. Материал считается прошедшим контроль, если в течение указанного срока инкубации остаются живыми не менее 80 % инокулированных эмбрионов и реакция гемагглютинации во всех случаях оказывается отрицательной. [c.108]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология